Cellulært uttrykk av miR-143 og miR-145, påvist ved in-situ hybridisering i parafininnstøpt vev.

Abstract

Hensikten med prosjektet var å utføre in situ hybridisering for å undersøke lokalisasjonen til spesifikke mikroRNA-molekyler i vevsområder med celleforandringer og betennelsesreaksjon. Dette ble utført for vevsområder med celleforandringer som kondroid syringeom, pleomorf adenom, adenokarsinom, infiltrerende karsinom, nyrecellekarsinom, og granulasjonsvev. Fokuset i oppgaven er å undersøke hvor miRNA-molekylene miR-143 og miR-145 er lokalisert i vevsområdene, og om det potensielt er en korrelasjon mellom dem og kreftutvikling.

miRNA er små RNA-sekvenser som virker å være en kritisk del av cellenes reguleringssystem, og de antas å være involvert ved en rekke sykdommer. De er spesielt assosiert med kreft, da det antas at de fungerer som tumorsuppressorer. På grunn av dette har interessen for å tilegne seg mer kunnskap om de økt betraktelig det siste tiåret, og derfor er det mange studier som undersøker akkurat dette. De fleste studier går ut på å kvantifisere ekstrahert miRNA-materiale ved hjelp av qPCR. Fra studiene som benytter PCR-teknikker viser resultatene at vev med celleforandringer har lavere mengde av miRNA-molekyler enn vev som ikke er tumoraffisiert. Disse studiene undersøker bare mengden av miRNA-molekylene og ikke hvor de er lokalisert i vevsområdene, derfor er det mye usikkerhet om resultatene virkelig er reelle. En metode som potensielt kan minske denne usikkerheten er in situ hybridisering (ISH), som er en semi-kvantitativ metode og baserer seg på hybridisering mellom en probe og nukleinsyren som skal undersøkes. På denne måten kan lokalisasjonen til miRNA-molekylene undersøkes i vevet (1–8).

ISH-prosedyren utføres manuelt, med maks antall prøver på ti og en tidsbruk på minst syv og en halv time. Det viser seg at siden ISH er en manuell metode, har den mange mulige feilkilder som kan skape relativt store individuelle forskjeller i kvalitet mellom prøvesnittene.

Selv om ISH er en relativt usikker metode med mange mulige feilkilder, virker det som at miR-143 og miR-145 normalt produseres i celler med kontraktile egenskaper, som muskelceller, myofibroblaster og myoepiteliale celler. Ved kreft eller betennelsestilstander viser det seg at produksjon av miR-145 kan foregå i andre celler, som i epiteliale celler nærliggende tumoraffisert vevsområde eller myoepiteliale tumorceller i benigne tumorer og ved tilfeller av infiltrerende karsinom av typen NST. Hvorvidt miR-145 kan produseres i andre krefttyper gir ikke denne oppgaven svar på, og dette må undersøkes ytterligere. Ut ifra lokalisasjonen til miRNA-molekylene kan det tenkes at miR-145 er spesielt viktig for utvikling av tumorstroma og tumorinvasjon.

Resultatene i denne oppgaven vil ikke ha noen direkte effekt på diagnostisering eller behandling av kreft, men kan være et springbrett for videre forskning innenfor temaet.

The aim of the project was to carry out in situ hybridization to investigate the location of specific microRNA molecules in tissue regions with cell transformation and inflammatory response. The tissue regions used in this project had cell neoplasm such as chondroid acidoma, pleomorphic adenoma, adenoma carcinoma, renal cell carcinoma and granulation tissue. The focus of the thesis is to investigate where the miRNAs miR-143 and miR-145 are located in the tissue areas, and whether there is a potential correlation between them and cancer development.

miRNAs are small RNA sequences that appear to be a critical part of the cell’s regulatory system and are believed to be involved in a variety of diseases. They are especially associated with cancer, as they are believed to act as tumor suppressors. Because of this, interest in acquiring more knowledge about them has increased significantly over the past decade, and there are therefore many scientific studies examining just this. Most scientific studies are based on quantifying extracted miRNAs using qPCR. The results generally shows that tissue regions whit cell neoplasm have lower amounts of miRNA molecules than non-tumor-associated tissues. By using the PCR method, they only examine the amount miRNA molecules and not their location in the tissue region, so there is a lot of uncertainty as to whether the results are real. There is one method that can potentially reduce this uncertainty, and that is in situ hybridization which is a semi-quantitative method based on hybridization between a probe and the nucleic acid to be investigated. In this way, the location of the miRNA molecules can be examined in the tissue sample (1–8).

The ISH procedure is performed manually, and takes at least seven and a half hour. The method has a capacity of ten tissue samples per analysis. It turns out that since ISH is a manual method, it has many possible sources of error that can create relatively large individual differences in quality between the sample sections.

Although ISH is a relatively uncertain method with many possible sources of error, it appears that miR-143 and miR-145 are normally produced in cells with contractile properties, such as muscle cells, myofibroblasts and myoepithelial cells. However, in cancer or inflammatory conditions, production of miR-145 may occur in other cells, such as epithelial cells adjacent to the tumor affected tissue region or myoepithelial tumor cells in benign and in cases of infiltrating carcinoma of the type NST. The question whether miR-145 can be produced in other types of cancer is not answered in this thesis, and needs further investigation. From the location of the miRNA molecules, it is conceivable that miR-145 is important for the development of tumor stroma and tumor invasion.

The results from this thesis will have no direct effect on the diagnosis or treatment of cancer, but may be a stepping stone for further research within the topic of miRNA molecules and their correlation to cancer.