Cytotoxicity and repair of uracil and 5-fluorouracil in DNA

Abstract

Cytotoksisitet og reparasjon av uracil og 5-fluorouracil i DNA Vårt arvemateriale (gener) er organisert i 23 kromosompar, som det finnes fullstendige kopier av i storparten av våre celler. Hvert kromosom består av en lang DNA-tråd som inneholder genetisk informasjon. For at våre gener skal kunne overføres intakt til neste generasjon krever det at disse DNA trådene ikke endres betydelig fra fødsel til reproduksjon. DNA skades daglig av stråling og kjemikaler utenifra, men også gjennom spontant forfall og fra biprodukter fra cellenes naturlige prosesser. DNA-skader er derfor uunngåelig og må kontinuerlig repareres for å unngå mutasjoner som kan føre til blant annet celledød og kreft.

Det finnes flere viktige systemer for reparasjon av DNA, og denne avhandlingen omhandler spesielt reparasjon av skadede DNA-baser av typen pyrimidiner, og spesielt uracil (U) og cellegiften 5-fluorouracil (5-FU). Uracil forekommer normalt i RNA, men skal normalt ikke finnes i DNA. Likevel settes av og til uracil inn i DNA i stedet for normalbasen tymin, da de kjemisk sett er veldig like. I tillegg kan normalbasen cytosin spontant miste en aminogruppe (deaminering) og omdannes til uracil. Dette danner et uracil:guanin basepar, som gir mutasjoner hvis DNAet ikke repareres før det kopieres under celledeling. En kontrollert variant av denne mutagene DNA-skadende prosessen utnyttes også normalt i B celler som del av vårt ervervede immunforsvar. Cytosin i immunglobulingener deamineres aktivt av enzymet AID, som igjen gjenkjennes og kuttes ut av enzymet uracil-DNA-glykosylase (UNG). Dette er den viktigste molekylære mekanismen bak modningen av antistoffer.

I artikkel 1 har vi kartlagt de molekylære mekanismene for gjenkjenning og utkutting av uracil fra DNA ved de sentrale uracil-DNA glykolsylasene UNG2 og SMUG1. SMUG1s ble ved mutasjonsstudier bekreftet å reparere DNA ved mekanismer som ligner andre typiske uracil-DNA glykosylaser. Gjenkjenningen av uracil og binding til DNA etter utkutting ble imidlertid funnet å være ulik mellom UNG2 og SMUG1, noe som muligens rettferdiggjør tilstedeværelsen av to enzymer som gjør noenlunde samme ting. SMUG1 viste en større preferanse for U:G basepar, og var mindre aktiv i reparasjon av feilinkorporert uracil (U:A). Dette ble også vist i levende bakterier, hvor reparasjon av U:G basepar ved overuttrykt human SMUG1, men ikke UNG2, førte til celleskade. Det molekylære grunnlaget for disse ulikhetene ble blant annet vist å være at SMUG1, gjennom et unikt strukturelt element, binder DNA etter utkutting av skadede baser. Dette beskytter muligens DNAet og rekrutter andre nødvendige reparasjonsenzymer. SMUG1 synes dermed optimalisert for "sakte" reparasjon, mens UNG2 er på sin side er egnet til hurtig reparasjon av uracil sammen med replikasjonsmaskineriet ved at den blant annet ikke binder sitt DNA sterkt etter utkutting.

I artikkel 4 viser vi at denne UNG2 reparasjonen er assosiert med to ulike proteinkomplekser under kopieringen av DNA. Vi foreslår en modell hvor UNG2 antagelig reparerer feilinkorporert uracil etter replikasjonsmaskineriet, og U:G basepar i et kompleks med proteinet XRCC1 før replikasjonsmaskineriet. Det er viktig at U:G basepar repareres før DNAet kopieres og gir mutasjoner.

At UNG2 er et replikasjonsassosiert protein underbygges i artikkel 3. UNG2, i motsetning til SMUG1, er cellesyklusregulert og uttrykkes i ca. 3 ganger høyere nivå før replikasjon av DNA - den såkalte syntese fasen (Sfase). Vi viser at uregulert overuttrykk av UNG2 også utenfor S-fase gjør at cellesyklus stopper opp, og at et slikt overuttrykk gjør at uracil-reparasjonen blir forstyrret slik at reparasjonsmaskineriet nedstrøms ikke henger med. Denne potensielt mutagene prosessen også tenkes å brukes funksjonelt i stimulerte B celler, hvor det er vist at uttrykket av UNG2 øker 10 ganger og kontrollert mutagenese er ønskelig.

At reparasjon av DNA kan være cytotoksisk blir også utnyttet i kreftbehandling med cellegift. 5-FU brukes av over 2 millioner pasienter årlig og er en hjørnestein i behandlingen av de vanligste solide kreftformer i blant annet mage og tarm. 5-FU er en syntetisk base som ikke finnes normalt i mennesker. Til tross for over 50 år med forskning og klinisk bruk er dens virkningsmekanisme og mekanismer for utvikling av resistens fortsatt under debatt. 5-FU og dens metabolitter er vist å hemme nydannelsen av dTMP fra dUMP via enzymet tymidylat syntetase. dTMP er "forstadiet" til dTTP som brukes til å bygge inn den normale basen tymin i DNA, og er dermed nødvendig for at celler skal kunne danne nytt DNA og dele seg. 5-FU kan også i seg selv metaboliseres og inkorporeres i både RNA og DNA, som virker forstyrrende på flere av deres funksjoner. 5-FU i DNA kan repareres ved både mismatchreparasjon (MMR) og base-eksisjonsreparasjon (BER), initiert av blant annet de nevnte uracil-DNA-glykosylasene UNG2 og SMUG1. Vi viser at BER initiert av UNG2 er hovedmekanismen for fjerning av 5-FU fra DNA i humane kreftceller, men at denne reparasjonen ikke utgjør noen viktig del av virkningsmekanismen til 5-FU. Vi finner at 5- FU primært inkorporeres i RNA og at dette utgjør den viktigste virkningsmekanismen til medikamentet for kreftceller i kultur.