Mechanisms of Toll-like Receptor 9 Activation

Abstract

The innate immune system consists of several pattern recognition receptors (PRRs), which recognize invading microorganisms by specific pathogen associated molecular patterns (PAMPs). Toll-like receptors (TLRs) are an important group of PRRs. To date, thirteen mammalian TLRs have been identified. TLRs are type I transmembrane receptors with a pathogen binding ectodomain (ECD) consisting of leucine-rich repeats (LRRs) and a cytoplasmic signaling domain, known as the toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain. The TLR ECDs consist of a solenoid with 19-25 LRRs bent into a horseshoe shape. Certain LRRs are followed by insertions of amino acid sequences, which have been implicated in the recognition of PAMPs by TLRs.

TLR9 is a receptor for DNA and synthetic oligodeoxynucleotides, and interacts with its ligand in endosomal compartments. We introduce a novel TLR9 agonist, which is able to override species-specific recognition of CpG motifs by TLR9. The agonist is shown to activate TLR9 from various species to induce an immune response. Moreover, it has been suggested that TLR9 is cleaved in the endosomes to yield a functional receptor. This cleavage of the receptor deletes the N-terminal part of the receptor, creating a functional receptor consisting of only the C terminal ECD. However, less is known about the function of the N-terminal domain of the receptor. We identified an important role for cysteine rich regions in the insert following LRR8 in the N-terminal TLR9 ECD for the induction of an immune response. TLR9 protein with specific mutations from cysteine to alanine in these motifs lost the ability to induce an immune response upon activation with a TLR9 agonist. The mutated proteins were able to bind ligand, but confocal imaging revealed the mutant proteins unable to translocate from the ER to ligand-containing compartments. This defect in trafficking was shown to be due to a decreased ability of mutant TLR9 to bind the transport protein UNC93B1. These results suggest that the N-terminal part of the TLR9 ECD plays a critical role in the normal cellular responses to its ligands.

By doing a broad analysis of genes induced by a TLR9 agonist in wild type C57Bl6, Tlr9-/- and Myd88-/- myeloid dendritic cells (mDCs) we identified the antiviral gene viperin to be highly induced. In addition, we found that the transcription factor interferon regulatory factor (IRF) 5, and not IRF7, was central for TLR9 agonist induction of type I interferon (IFN) and viperin in mDCs. Furthermore, we identified a novel and important role for IRF5 in the in vivo antiviral response to murine cytomegalovirus (MCMV) infection. Irf5-/- mice showed a higher susceptibility to MCMV infection compared to wild type control mice. Irf5-/-mice displayed a higher viral titer in the spleen, increased liver pathology and decreased serum levels of proinflammatory cytokines and IFNs.

The results presented in this thesis improve our general understanding of TLR9 and its activation by natural and synthetic ligands to induce an immune response. Our results may contribute to the design of future vaccine adjuvants, cancer treatments and anti-viral therapies directed against CMV infections.

MEKANISMER FOR AKTIVERING AV TOLL-LIGNENDE RESEPTOR (TLR) 9

Kroppen eksponeres kontinuerlig for infeksiøse agens og skader som kan forårsake sykdommer. Immunforsvarets oppgave er å kjenne igjen disse som fremmed og sette i gang en riktig immunrespons for å bekjempe inntrengerne eller skaden. Immunforsvaret kan deles inn i medfødt og ervervet forsvar. Det medfødte forsvaret vil være det første som settes i gang ved en eventuell infeksjon, og vil forme den ervervede immunresponsen til å være mest effektiv avhengig av hva kroppen er infisert med. Det medfødte immunforsvaret består blant annet av celler som utrykker ulike sensorer, såkalte reseptorer, som overvåker miljøet både utenfor og inne i cellene. Toll-liknende reseptorer (TLR) utgjør en viktig gruppe i det medfødte immunforsvaret. Ved aktivering av TLR vil en lang kjede med hendelser starte inne i cellene som utløser betennelsesreaksjoner, som fører til at infeksjonen blir bekjempet eller skaden reparert.

TLR9 er reseptor for en type bakterielt og viral DNA i mange immunreaksjoner, og kan gjenkjenne kroppen sitt eget DNA i autoimmune reaksjoner og sykdommer. TLR9 kan også kjenne igjen syntetisk DNA, som vil aktivere TLR9 på lik linje med bakterielt og viralt DNA. Dermed kan syntetisk DNA brukes som en TLR9 aktivator (TLR9 ligand) i modeller for å studere effekter av viralt, bakterielt eller kroppens eget DNA. TLR9-induserte immunresponser er vist å ha antivirale egenskaper. Dette innebærer aktivering av spesielle celler som spesifikt vil angripe virusinfiserte celler, og dermed begrense replikasjon av virus og videre spredning. Det er også vist at en TLR9 mediert respons kan til føre til økt uttrykk av spesielle molekyler hos immunceller som vil kunne delta i angrep på kreftceller, og dermed redusere tumorvekst. En annen viktig funksjon av en TLR9-mediert immunrespons er evnen til å aktiverer en spesiell del av det medfødte immunforsvaret, som kan redusere allergiske reaksjoner. Da syntetisk DNA kan indusere en aktivering av det medfødte immunforsvaret, er disse i tillegg, ved hjelp av dyremodeller, vist å kunne utnyttes som adjuvans i vaksiner. Adjuvans er stoffer som øker effekten av vaksiner.

Målet med dette prosjektet var å kartlegge områder i TLR9 som er viktig for interaksjon mellom TLR9 og DNA, og induksjon av den påfølgende immunrespons.

I dette studiet presenterer vi en ny syntetisk DNA oligo som aktiverer både humant og mus TLR9. Tidligere studier har vist at mange DNA oligoer som gir et TLR9 signal er artspesifikke, det vil si at TLR9 ligander som aktiverer human TLR9 ikke aktiverer mus TLR9, og vice versa. Det blir derfor benyttet ulike TLR9 ligander i prekliniske dyremodellstudier og i kliniske studier. Resultatene fra dyremodeller kan følgelig ikke direkte overføres til menneskestudier. Introduksjon av denne nye liganden muliggjør en lettere overgangen fra dyrestudier til menneskestudier, og er et viktig ledd i utviklingen av TLR9 ligander som kan brukes som blant annet adjuvans i vaksiner og kreftbehandling.

Videre har vi kartlagt områder i reseptoren som viste seg å ikke påvirke binding av DNA til TLR9, men som er viktig for at en vellykket immunrespons skal settes i gang ved en bakteriell eller viral infeksjon. Ved å studere celler som uttrykker TLR9 med mutasjoner i disse områdene i mikroskop, har vi påvist at mutert TLR9 ikke uttrykkes i de samme områdene inne i cellen som det immunstimulerende DNA som er tilsatt cellene. Mutasjonene i TLR9 hindrer trafikkering av TLR9 inne i cellen til områder hvor den ellers vil binde DNA og sette i gang en immunrespons. Dermed vil nærvær av disse mutasjonene avbryte hele signaloverførselen og aktivering av immunforsvaret. Dette er funn som vil være viktig for den videre utviklingen av syntetisk DNA TLR9 ligander som adjuvans i vaksiner.

TLR9 er foreslått å være involvert i å indusere en effektiv immunrespons ved infeksjon med cytomegalovirus (CMV). Dette er et virus som ikke er farlig for personer med et intakt immunforsvar. For personer med et svekket immunforsvar, som for eksempel kreftpasienter som behandles med cellegift og AIDS-pasienter, er derimot dette et virus som kan gi fatale følger. Dyremodell med infeksjon av murint (mus) CMV er en anerkjent modell for å studere dette viruset. En type signalmolekyler som kalles type I interferoner kan bli indusert ved virusinfeksjon og TLR9 aktivering og er viktig i bekjempelsen av virus. Ved å ta i bruk ulike mus med defekte signalmolekyler i TLR9-interferonresponser, spesielt et protein som kalles IRF5, har vi kartlagt nye signalveier i den antivirale responsen som initieres ved en CMV infeksjon. Dette er funn som er viktig for å bedre forståelsen av immunresponsen som settes i gang ved en CMV infeksjon og dermed også utvikling av nye antivirale medikamenter som kan være nyttige for bruk hos kreftpasienter og andre med redusert evne til å bekjempe CMV. For å oppsummere; våre resultater kan bidra til å øke forståelsen av TLR9-aktiverte immunreaksjoner. Dette kan igjen føre til framgang når det gjelder videre forskning på vaksiner og terapier for sykdommer som involverer disse signalveiene, slik som medisiner for virusinfeksjoner og autoimmune sykdommer.