ATP-Dependent Citrate Lyase and Glycerol 3-Phosphate Dehydrogenase in Aurantiochytrium T66: An Attempted In Vivo Analysis and Heterologous Expression

Abstract

Thraustochytrider er industrielt interessante mikroorganismer på grunn av deres evne til å produsere store mengder lipider, spesielt omega-3 fettsyren dokosaheksaensyre (DHA). Metabolismen til disse organismene er ikke fullstendig kartlagt. Utredningen av mekanismene bak fettsyreproduksjonen i disse organismene er viktig for å kunne forbedre utbyttet av DHA ved industrielle fermenteringer. Auromegaprosjektet, som dette oppgaven er en del av, jobber for å bedre forstå og modellere metabolismen til thraustochytriden Aurantiochytrium T66. Formålet med denne oppgaven var å identifisere tilstedeværelsen av enzymet ATP-avhengig sitrat lyase (ACL) og kofaktoravhengigheten til de to ulike glyserol 3-fosfat dehydrogenasene (G3PDH) i Aurantiochytrium T66. Fem kandidatgener som kunne kode for disse enzymene ble valgt ut av Auromegagruppen. Gen T66006817.1, T66010760.1 og T66009329.1 var kandidatgener for ACL, mens gen T66008081.2 og T66006468.1 var kandidatgener for G3PDH. Ingen av kandidatgenene for ACL var annotert som dette enzymet. Disse var annotert som enzymer som katalyserer lignende reaksjoner. Fraværet av gode kandidatgener for ACL kunne bety at Aurantiochytrium T66 ikke har dette enzymet. ACL er et enzym som er involvert i å skaffe acetyl-CoA til lipidsyntese i cytosol. Hvis dette ensymet ikke er til stede, vil det bety at en annen mekanisme benyttes for å forsyne fettsyresyntesen med substrat. Kofaktoravhengigheten til G3PDH var interessant å se nærmere på, fordi avhengigheten av enten NADH eller NADPH vil være viktig informasjon for modelleringen av organismens metabolisme. G3PDH er involvert i produksjonen av glyserol 3-fosfat, som utgjør en sentral del av triglyserider. Fettsyrer lagres ofte som triglyserider i organismer som akkumulerer lipider. Kandidatgenene ble klonet inn i ekspresjonsvektorer basert på RK2 plasmidet med et Pm/XylS promotorsystem. Vektorene inneholdt en sekvens som kodet for en C-terminal His-tag, hvilket gjorde utrensing med immobilisert metallaffinitetskromatografi (IMAC) mulig. Plasmidene ble overført til Escherichia coli. Rekombinant protein ble forsøkt utrenset med IMAC, men genene kunne ikke uttrykkes med dette oppsettet. Ulike strategier ble forsøkt for å forbedre uttrykket. Dyrkningstemperaturen i E. coli ble senket. Uttrykk i Pseudomonas putida med ulike protokoller i forhold til celletetthet ved induksjon og induksjonssubstanskonsentrasjon ble forsøkt. Bruken av signalpeptidet PelB ble forsøkt i både E. coli og P. putida. Ingen av disse strategiene ga signifikant utbytte av peptidene når SDS-PAGE ble utført. En alternativ strategi var å måle enzymaktivitet i Aurantiochytrium T66. Schizochytrium S21 ble brukt som en kontroll hvor ACL aktivitet var tidligere rapportert. Vekstkurver for begge organismene ble laget, og prøver for enzymaktivitetsmålinger ble tatt i både eksponentiellfase og i overgangen til stasjonærfase. Cellekulturprøvene ble forsøkt lysert ved sonikering. Lysering viste seg å være vanskelig, og proteinutbyttet var lavt. ACL og G3PDH aktivitetsmålinger ble likevel utført. For G3PDH ble målinger med både NADH og NADPH utført. Målingene viste ingen signifikant aktivitet for hverken ACL eller G3PDH. Aktivitetsmålingsprotokollene ble verifisert ved å teste kommersielt produserte enzymer. Siden ACL aktivitet i Schizochytrium S21 var tidligere rapportert og G3PDH-kandidatene i Aurantiochytrium T66 viste god homologi med karakteriserte enzymer, ble det antatt at aktivitetsmålingene var negative på grunn av lyseringsproblemene.

Thraustochytrids are industrially interesting microorganisms because of their ability to produce large amounts of lipids, especially the omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid (DHA). The metabolism of these organisms is not completely understood. The unravelling of the underlying mechanisms of lipid production in these organisms is of great importance in order to achieve better yields of DHA in industrial fermentation. The Auromega project, of which this thesis is a part, attempts to understand and model the metabolism of the thraustochytrid Aurantiochytrium T66. The object of this thesis was to identify the presence of the enzyme ATP-dependent citrate lyase (ACL) and the cofactor requirements glycerol 3-phosphate dehydrogenase (G3PDH) in Aurantiochytrium T66. Five genes of interest possibly encoding these enzymes were provided by the Auromega project group. Gene T66006817.1, T66010760.1, and T66009329.1 were candidate genes for encoding ACL, while gene T66008081.2 and T66006468.1 were candidate genes for encoding G3PDH. None of the candidate genes for ACL were annotated as ACL, but as enzymes catalyzing similar reactions. The absence of good ACL candidates could mean that Aurantiochytrium T66 does not have the ACL enzyme at all. ATP-dependent citrate lyase is an enzyme involved in providing acetyl-CoA for the lipid synthesis in the cytosol. The absence of this enzyme would mean that some other mechanism provides acetyl-CoA for lipid synthesis. The cofactor requirements of G3PDH was interesting to investigate, because the requirements of either NADH or NADPH would be important for modelling of the metabolism. G3PDH is involved in the production of glycerol 3-phosphate, which is the backbone for triacylglycerols. Fatty acids are commonly stored as triacylglycerols in lipid accumulating organisms. The genes were cloned into expression vectors based on the RK2 plasmid using a Pm/XylS promoter system. The vectors contained a sequence encoding a C-terminal His-tag, thus enabling purification by immobilized metal-affinity chromatography (IMAC). The plasmids were transferred to Escherichia coli. Recombinant protein was attempted purified by IMAC, but the genes of interest could not be expressed using the initial set up. Different strategies to improve expression were then applied. Growth temperature in E. coli was lowered. Expression was attempted in Pseudomonas putida with different protocols with regards to cell density at induction and inducer concentration. The use of the signal peptide PelB was attempted in both E. coli and P. putida. None of these strategies yielded a significant yield of the proteins of interest when SDS-PAGE was performed. A second approach was to assay activity in Aurantiochytrium T66. Schizochytrium S21 was used as a control where ACL activity had been previously reported. Growth curves for both organisms were made, and samples for enzyme assays were taken in the exponential faze and in the transition to the stationary faze. The culture samples were attempted lysed using sonication. Lysis of the cells proved difficult, and the protein yields were low. ACL and G3PDH assays were nevertheless performed on the protein extracted. For G3PDH, both assays with NADH and NADPH as cofactors were performed. The assays did not show any significant activity of neither ACL nor G3PDH. The assay protocols were verified using commercially produced enzymes. Since Schizochytrium S21 has been reported to have ACL activity and the assumed G3PDH genes in Aurantiochytrium T66 showed good homology to genes encoding characterized enzymes, the failure of the assays was probably caused by the inefficient lysis.