Vis enkel innførsel

dc.contributor.advisorErtesvåg, Helga
dc.contributor.authorDahl, Marie Duus
dc.date.accessioned2019-11-19T15:00:16Z
dc.date.available2019-11-19T15:00:16Z
dc.date.issued2019
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11250/2629342
dc.description.abstractAzotobacter vinelandii er en alginatproduserende bakterie med en viss industriell interesse. Alginat er en biopolymer benyttet i mange industrielle felt på grunn av dens geldannende egenskap. Bakteriell alginat har en annen sammensetning enn alginat fra alger, og produksjonen reguleres og kontrolleres enklere i bakterier. Homolog rekombinering er benyttet i A. vinelandii som et muteringsverktøy for å produsere alginat med ønskede egenskaper. Utfordringen er at bakterien har mange kopier av kromosomet sitt. Resultatet av homolog rekombinering er en blanding av vildtype og muterte kromosom, og det er nødvendig med en langvarig prosess for å oppnå de ønskede mutantene. CRISPR-Cas9 er et relativt nytt muteringssystem som kan mutere flere kromosom samtidig. I løpet av dette arbeidet har vektorer for et CRISPR-Cas9 mutetingssystem blitt utviklet for A. vinelandii for å se om dette systemet kan gi høyere mutasjonsfrekvens enn homolog rekombinering, eller om det kan benyttes for å fjerne uønskede kromosom. CRISPR-Cas9 består av en endonuclease, Cas9, og et guide RNA som bindes til Cas9 og leder det til målsekvensen. Målsekvensen vil bli kuttet når Cas9 binder seg. Kuttet kan bli reparert ved homolog rekombinering. En kloningsplan ble utviklet for å konstruere to plasmid med de nødvendige CRISPR-Cas9 komponentene - et med genet som koder for Cas9 og et annet med et gen som koder for gRNAet. Systemet ble designet for å teste dødeligheten og mutasjonsfrekvensen til systemet. Plasmid pMDD8 er den endelige vektoren for Cas9, og pMDD13, pMDD15, pMDD16, og pMDD17 er fire varianter av gRNA vektoren. uidA og mucA ble valgt som målgen for blå-hvit fargetest og for å gi en alginat overproduserende stamme, respektivt. To-plasmid CRISPR-Cas9 muteringssystemet designet i denne oppgaven ble ikke testet siden de gRNA-kodende vektorene ikke kunne bli konjugert inn i A. vinelandii. Det kan derfor ikke konkluderes om CRISPR vil være en forbedring for homolog rekombinering som et muteringssystem i bakterien. Mulige årsaker for hvorfor systemet ikke virker har blitt diskutert, og forslag for et endret system basert på vektorene designet i dette arbeidet.
dc.description.abstractAzotobacter vinelandii is an alginate producing bacterium of some industrial interest. Alginate is a biopolymer used in many industrial fields because of its gel-forming ability. Bacterial alginate has a different composition from algal alginate, and the production can be regulated and controlled more easily in bacteria. Homologous recombination is used in A. vinelandii as a mutagenesis tool to produce alginate with wanted properties. The challenge lies in the bacterium having many copies of its chromosome. The result of homologous recombination is a mixture of wild-type and mutated chromosomes, and a lengthy process to obtain the desired mutants is necessary. CRISPR-Cas9 is a relatively new mutagenesis system that is known to mutagenize several chromosomes at the same time. During this work, vectors for a CRISPR-Cas9 mutagenesis system have been developed for A. vinelandii, to look into whether this system can give higher mutation frequencies than homologous recombination, or if it can be used to remove unwanted chromosomes. CRISPR-Cas9 consists of an endonuclease, Cas9, and a guide RNA that binds to Cas9 and guides it to the target sequence. Binding of Cas9 to the target result in cleavage of the sequence, which can be repaired through homology-directed repair. A cloning plan was developed to construct two plasmids with the necessary CRISPR-Cas9 components - one with the gene encoding Cas9 and a second with a gene encoding the gRNA. The system was designed to test the lethality and the mutagenesis frequency of the system. Plasmid pMDD8 was the final vector for Cas9, and pMDD13, pMDD15, pMDD16, and pMDD17 were four variants of the gRNA vector. uidA and mucA were chosen as target genes for blue-white plate screening and to yield an alginate overproducing strain, respectively. The two-plasmid CRISPR-Cas9 mutagenesis system designed in this work could not be tested since the gRNA-encoding vectors would not be conjugated into A. vinelandii. There can therefore not be concluded if CRISPR will be an improvement to homologous recombination as a mutagenesis tool in the bacterium. Possible reasons for why the system does not work have been discussed, and suggestions for an altered system based on the vectors designed in this study.
dc.languageeng
dc.publisherNTNU
dc.titleKonstruksjon av vektorer for et CRISPR-Cas9 muteringssystem for Azotobacter vinelandii
dc.typeMaster thesis


Tilhørende fil(er)

Thumbnail

Denne innførselen finnes i følgende samling(er)

Vis enkel innførsel