Investigation of bioactive properties of fish protein hydrolysates: Antioxidant activity and ACE inhibitory activity

Abstract

Utilstrekkelig utnyttelse av fiskerestråstoff er et av hovedproblemene for fiskeindustrien i dag. Ressursene i havet er begrensede, og restråstoff som ikke er godt nok utnyttet kan skape miljø-problemer og samtidig påvirke økonomien i fiskeri og akvakultursektoren. Det er derfor av stor interesse å utnytte biprodukter så optimalt som mulig. Selv om situasjonen i Norge er relativt god, har hvitfisksektor et potensial for forbedring. Utnyttelse kan optimaliseres ved å utvinne bioaktive forbindelser fra restråstoff. På grunn av egenskapene til disse forbindelsene kan de brukes som matingredienser eller til produksjon av legemidler.

Målet med denne oppgaven var å undersøke bioaktive egenskaper til proteinhydrolysater, forbedre analytiske metoder og utføre membranfiltrering på noen hydrolysater. Sammenheng mellom strukturelle og bioaktive egenskaper av hydrolysater ble også undersøkt. Proteinhydrolysater fra torskehoder produsert av SINTEF Ocean i pilotprosjektet HEADS UP og kommersielt produsert laskeproteinhydrolysat ble analysert for antioksidantaktivitet og blodtrykkssenkende effekt (ACE inhiberende aktivitet). I tillegg ble strukturelle egenskaper som totalt innhold og fri innhold av aminosyrer, molekylvektfordeling, proteininnhold, og mengde syreløselige peptider bestemt. To hydrolysater ble membranfiltrert for å finne ut om molekylvekt påvirket bioaktivitetene, men separasjonen var ikke så skarp som ønsket. Ett torskehydrolysat ble filtrert to ganger for å forsøke å forbedre separasjonsgraden. Dette forbedret separasjonen til en viss grad.

Antioksidantaktivitet ble målt med to forskjellige metoder: ABTS metoden og redusering av FC-reagens. Resultatene viste at permeat (< 4 kDa) hadde den høyeste inhiberingen av ABTS radikaler, sammenlignet med ufiltrerte hydrolysater og retentat (> 4 kDa). Torskeproteinhydrolysat som ble laget med sitronsyre viste den laveste inhiberingen av ABTS radikaler, noe som tyder på at antioksidant aktivitet kan være avhengig av pH. Bidrag fra fri tyrosin og frie aromatiske aminosyrer ble også observert. Det var ingen korrelasjon mellom resultatene fra FC metoden og ABTS metoden. De to metodene måler forskjellige ting, og korrelasjonen må tolkes med forsiktighet.

ACE inhiberende aktivitet ble også bestemt ved to metoder: spektrofotometrisk ved Cushman og Cheungs metode (1971) og fluorescens ved Sentandreu og Toldràs metode (2006). Etter grundig etterforskning ble en velfungerende prosedyre implementert for Cushman og Cheungs metode. For Sentandreu og Toldràs methode ble instillinger i fluorimeteret justert. ACE inihiberende aktivitet funnet med Sentandreu og Toldràs metoden, var svært lav sammenlignet med tidligere studier. Denne metoden bekreftet heller ikke behov for membranfiltrering, siden filtrerte fraksjoner har vist enda lavere ACE inhiberende aktivitet. Cushman og Cheungs metode viste bedre inhibering, men bare tre hydrolysater ble analysert.

Lagringstiden og betingelser kan ha påvirket egenskaper til fiskeproteinhydrolysater. Fiskeart, restråstoff-fraksjoner og hydrolysebetingelser påvirker bioaktiviteter. Det ble konkludert med at fiskeproteinhydrolysater har stort potensial for bruk i matvarer og legemidler, men flere studier er nødvendig for evaluering av bioaktiviteter i proteinhydrolysater under lagring og etter fordøyelsen.

The waste of and less than optimal use of fish by-products is one of the main problems for the fish industry today. Fish resources are limited, and underutilised by-products can have a great ecological impact and affect the economics of the fishing and aquaculture sector. It is therefore of great interest to utilise by-products as optimally as possible. Even though the situation in Norway is relatively good, the white fish area has the potential for improvement. Utilisation can be optimised by obtaining bioactive compounds from by-products. Due to their properties, these compounds can be used in the production of drugs or functional foods.

The main aim of the work in this thesis was to determine the bioactive properties of protein hydrolysates, improve the analytical methods and apply membrane filtration on several hydrolysates. Correlations between structural and bioactive properties of the hydrolysates were also analysed. Cod protein hydrolysates produced by SINTEF Ocean in the pilot project HEADS UP and a commercial salmon protein hydrolysate have been analysed for the presence of antioxidant activity and blood pressure lowering effect (ACE inhibitory activity). In addition, structural properties such as total and free amino acid content, molecular weight distribution, protein content and amount of acid soluble peptides were determined. Ultrafiltration was applied on two hydrolysates to find out if molecular weight influenced bioactivities. However, the separation was not as sharp as desired. Degree of separation was improved slightly by filtrating the hydrolysate twice.

Antioxidant activity was measured by two different methods: ABTS and FC assays. All hydrolysates were shown to have antioxidant activity. Results from the ABTS assay showed that the permeate (< 4 kDa) had significantly higher antioxidant activity compared to crude hydrolysate and retentate (> 4 kDa). Cod protein hydrolysate prepared with citric acid showed the lowest antioxidant activity by the ABTS assay, indicating that scavenging could be dependent on pH. Antioxidant activity increased with increasing content of free tyrosine and free aromatic amino acids. Results from the FC assay did not correlate with results from the ABTS assay. However, these methods differ in what they are measuring, so correlation should be interpreted carefully.

The ACE inhibitory activity of hydrolysates was also determined by two methods, spectrophotometric by Cushman and Cheung (1971) and fluorescence by Sentandreu og Toldrà (2006). After a thorough investigation, a well functioning protocol for Cushman and Cheung was implemented. For Sentandreu og Toldrà's method, some adjustments were needed in the fluorimeter. ACE inhibitory activity found by Sentandreu og Toldrà's method was very low compared to the previous studies. This method did not confirm the need for membrane filtration since UF fractions had lower ACE inhibitory activity. Cushman and Cheung's method showed significantly higher inhibition, but only three hydrolysates were analysed.

Storage time of hydrolysates could have influenced the properties of hydrolysates. Species, part of fish used for analysis, hydrolysis conditions influence the bioactivities. It was concluded that fish protein hydrolysates could have great potential to be used in foods and nutraceuticals, but more studies are needed for evaluation of biofunction availability in protein hydrolysates during storage and after digestion.