| dc.description.abstract | Thraustochytridar er heterotrofe, marine protistar, som har blitt kommersielt interessante dei siste tiåra sidan dei har ein høg produksjon av docosahexaensyre (DHA), som er ei langkjeda fleirumetta omega-3 feittsyre (LC-ω3-PUFA), i tillegg til skvalen og karotenoidar. LC-ω3-PUFA er essensielle feittsyrer og verdsette for sine mange helsemessige fortrinn, og sidan den noverande forsyninga i verda ikkje er nok til å dekke eit aukande forbruk, må alternative kjelder utviklast. Eit alternativ er oljer frå thraustochytridar, og Aurantiochytrium er ein av thraustochytride genera som har vist høgast DHA produktivitet. Det er derfor interessant å utvikle stammar av dette genuset til å auke DHA produksjonen og for å betre forstå biokjemien av DHA syntesen.
Ulike seleksjonsmarkørar blei utforska til å bli brukt på Aurantiochytrium sp. T66 og S61, sidan ein fungerande seleksjonsmetode enno ikkje eksisterer for desse stammane. Effektane av dei potensielle selektive sambindingane 5-fluoroorotsyre og 5-fluorocytosin på veksten av T66 og S61 blei undersøkte, noko som viste at stammane er resistente mot desse sambindingane. Dermed kan dei ikkje brukast som selektive sambindingar for desse stammane. Resistensen mot 5-fluorocytosin var ikkje overraskande, sidan eit BLAST søk viste at T66 truleg ikkje har eit gen som koder for cytosin deaminase, eit enzym som omgjer sambindinga til den giftige sambindinga 5-fluorouracil. Dette tyder derimot på at 5-fluorocytosin kan brukast til motseleksjon i desse stammane, noko som kan vere interessant dersom ein fungerande grunnleggjande seleksjonsmetode blir etablert.
Resistensgen mot dei antibiotiske stoffa cykloheksimid og zeocin (høvesvis eit mutert gen som koder for det ribosomale proteinet L44, og Sh ble genet) blei også utforska som potensielle seleksjonsmarkørar. Ved elektroporering av T66 og S61 med desse gena, var falske positive eit tilbakevendande problem. I tillegg blei transformasjonar av Sh ble genet, der også ein kombinasjon av elektroporering og rysting med glasskuler blei testa, vist å ikkje vere vellykka etter testing av nokre resulterande koloniar ved hjelp av PCR amplifikasjon. Dette tyder på at transformasjonsmetoden og seleksjonsprosedyrene må utviklast vidare.
Ein annan potensiell seleksjonsmetode er komplementering av auxotrofe mutantar. For å utforske dette blei 10 000 koloniar frå ein mutert kultur av Aurantiochytrium sp. T66 screena for auxotrofe mutantar ved hjelp av replikaplating på rikt og minimalmedium, og fem koloniar som ikkje kunne vekse på minimalmedium blei dyrka med kvar av dei 20 proteinogeniske aminosyrene, uracil eller adenin. Ein mutant vaks noko betre på uracil og aspartat, men dette er truleg ikkje eit resultat av éin mutasjon. Ein annan mutant vaks noko betre på glutamat og glutamin, som kan ha tyda på problem med nitrogenassimilering på grunn av ein glutamat/glutamin auxotrofi. Dyrking av denne mutanten med rikeleg glutamat auka ikkje veksten, og det blei dermed ikkje stadfesta at denne mutanten var ein glutamat auxotrof. Ingen klar effekt blei observert av å dyrke dei andre mutantane med aminosyrer, uracil eller adenin, altså blei ingen auxotrofe mutantar stadfesta.
I thraustochytridar er hovudsporet for DHA syntese gjennom eit dedikert enzymkompleks. For å betre forstå korleis feittsyresyntase og DHA syntase systema fungerer i forhold til kvarandre, blei effekten av ulike feittsyresyntaseinhibitorar på feittsyreprofilen til T66 celler undersøkt ved hjelp av massespektrometri. Ingen av inhibitorane auka DHA produksjonen, men nokre av dei hadde ein effekt på andre feittsyrer. Dette tyda på at inhibering av feittsyresyntase ikkje auka fluxen gjennom DHA syntasen. | |
| dc.description.abstract | Thraustochytrids are heterotrophic, marine protists, which have become commercially interesting in the past decades because of their high productivity of docosahexaenoic acid (DHA), which is a long-chain polyunsaturated omega-3 fatty acid (LC-ω3-PUFA), as well as squalene and carotenoids. LC-ω3-PUFAs are
essential fatty acids and appreciated for their many health benefits, and as the current world supply is not enough to cover an increasing consumption, alternative sources must be further developed. An alternative is oils from thraustochytrids, and Aurantiochytrium is one of the thraustochytrid genera which have shown the
highest DHA productivity. It is therefore interesting to develop strains of this genus to enhance the DHA production and to better understand the biochemistry of the DHA synthesis.
Different selection markers to be used in Aurantiochytrium sp. strains T66 and S61 were explored, as a successful selection method does not yet exist for these strains. The effects of the potential selective compounds 5-fluoroorotic acid and 5-fluorocytosine on T66 and S61 growth, were evaluated, which showed that the strains are resistant to these compounds. Thus, they could not be used as selective compounds in these strains. The resistance to 5-fluorocytosine was not surprising, as a BLAST search showed that T66 most likely does not harbor a gene encoding cytosine deaminase, an enzyme which transforms the compound to the toxic compound 5-fluorouracil. However, this suggests that 5-fluorocytosine could be used as a counterselective compound in these strains, which could be relevant if a functional basic selection procedure is established.
Resistance genes to the antibiotics cycloheximide and zeocin (a mutated gene encoding ribosomal protein L44 and the Sh ble gene, respectively) were also explored as potential selection markers. After electroporation of T66 and S61 with these genes, false positives were a recurring problem. In addition, the transformations of the Sh ble gene, in which a combination of electroporation and agitation with glass beads was also tested, did not seem successful from testing a few resulting colonies by PCR amplification. This indicates that the transformation method and selection procedures must be further developed.
Another potential selection method is the complementation of auxotrophic mutants. To explore this, 10 000 colonies of mutant Aurantiochytrium sp. T66 were screened for auxotrophic mutants by replica plating on rich and minimal media, and five colonies which failed to grow on minimal medium were cultivated with each of the 20 proteinogenic amino acids, uracil or adenine. One mutant grew slightly better on uracil and aspartate, which most likely did not result from one mutation. Another mutant grew slightly better on glutamate and glutamine, which might have indicated problems with nitrogen assimilation due to a glutamate/glutamine auxotrophy. Cultivating this mutant with an abundance of glutamate did not improve the growth, and thus it was not established that it was a glutamate auxotroph. No apparent effect of cultivating the other mutants in the presence of any amino acids, uracil or adenine was observed, and thus no auxotrophic mutants were established.
In thraustochytrids, the major pathway for DHA synthesis is by a dedicated enzyme complex. To further understand how the fatty acid synthase and DHA synthase systems function in relation to each other, the effect of different fatty acid synthase inhibitors on the fatty acid profile of T66 cells was evaluated by mass
spectrometry. None of the inhibitors enhanced DHA production, although some of them affected other fatty acids. This indicated that inhibition of fatty acid synthase did not increase the flux through DHA synthase. | |
