Initiell bakterie kolonosering av Atlantisk lakseyngel ved bruke av et gnotobiotisk system

Abstract

Slimhinnevev kan bli funnet tilstede rundt alle dyrs kroppshulrom, i tillegg til fiskens skinn. Dette vevet utgjør en barriere mot mikrober og andre komponenter i det eksterne miljøet. Tarmen, og den tilhørende mikrobiotaen, er en av de mest studerte slimhinne overflatene, hvor det bakterielle samfunnet har vist seg til å bidra til denne barrieren gjennom en mengde mekanismer. Slimhinnen på fiskeskinnet er også kolonisert av en slik mikrobiota, men dens funksjon og komposisjon er lite forstått. Dette gjør at fiskeskinnet er en interessant struktur å undersøke, ettersom vi vet lite om koloniseringssuksessen av bakterier, og hvilken funksjon disse har ved slimhinne barrieren.

Hovedmålet for denne oppgaven var å undersøke den første koloniseringen av enkle bakterielle isolater på ny-klekte lakseyngler, ved å utføre et gnotobiotisk eksperiment. Bakteriefrie lakseyngler ble inokulert med enkle bakterie stammer, som tidligere hadde blitt isolert fra lakseyngel tarm og skinn. For å undersøke om noen av stammene var patogene, ble overlevelse av lakseyngler registrert hver dag under eksperimentet. Det ble også utført kvantifisering av den bakterielle mengden tilstede på skinnet og tarmen ved bruk av telling av kolonier på agar plater (CFU) og qPCR. I forkant av det gnotobiotiske forsøket, ble bakteriestammene klassifisert basert på nesten hele 16S rRNA genet, og karakterisert basert på deres vekst på generelt og mucin medium.

Bakterie stammene ble klassifisert på slekt- eller artsnivå som Bacillus sp., Pedobacter sp., Arthrobacter sp., Janthinobacterium lividum and Psychrobacter cibarius. Alle stammene kunne vokse på mucin, og ingen av dem ble observert til å være patogene for lakseynglene. Kvantifiseringen ved hjelp av CFU avslørte at ingen av bakteriene koloniserte tarmen til fisken, mens den høyeste bakterielle mengde på skinn ble observert for stammen J. lividum. Stammen Bacillus sp. koloniserte verken vannet eller fisken, og ble mistenkt til å representere en kontaminering som ikke originalt kom fra lakseyngel. Kvantifiseringen av den bakterielle mengden ved bruk av qPCR viste seg å være mislykket, ettersom fisken hadde for lave mengder bakterier på seg og prøvene var antageligvis dominert av verts DNA. De samlede resultatene viser at ulike bakterie stammer has ulik evne til å kolonisere slimhinne vevene til lakseyngler, hvor J. lividum var klart best på å kolonisere skinnet. Dette er veldig interessant siden J. lividum har også blitt vist å være medlem av skinn mikrobiotaen i noen amfibier og huden til mennesker, samtidig som den har vist å ha anti-bakterielle, anti-sopp og anti-kreft egenskaper.

Mucosal tissue, covering the body cavities of animals and the skin of fishes, constitutes a major barrier against microbes and other agents in the external environment. The gut and the resident mucosal microbiota are one of the most studied mucosal surfaces and the gut bacterial community has shown to contribute to the mucosal barrier through a number of mechanisms. The fish skin mucus is also colonized by an indigenous microbiota, but its function and composition are poorly understood. This makes the skin an interesting structure to investigate, as we know little about the colonization by bacteria, and which function they plays in the skin mucosal barrier.

The main goal for this study was to investigate the initial colonization by single bacterial isolates of developing salmon fry by conducting a short-term gnotobiotic experiment. Germ-free salmon fry (10 days-post hatching) was inoculated with single bacterial strains that had previously been isolated from salmon fry skin and gut. To investigate whether the strains were pathogenic to the fish, survival was examined every day during the experiment. Quantification of the bacterial load in the skin and gut were determined by conducting colony forming units (CFU) counts on agar plates and qPCR. Prior to the gnotobiotic experiment, the strains were classified based on almost the complete 16S rRNA gene and characterized based on their growth on general and mucin medium.

The strains were classified at the genus or species level as Bacillus sp., Pedobacter sp., Arthrobacter sp., Janthinobacterium lividum and Psychrobacter cibarius. All the strains were able to grow on mucin, and none of them were observed to be pathogenic to the salmon fry. The quantification using CFU counts revealed that the gut of the salmon fry was not colonized with any of the strains after three days of exposure, while the skin had the highest bacterial loads for the Janthinobacterium lividum strain. The Bacillus sp. strains did not colonize, neither the water nor the fish and were believed to represent a contamination, not originated from the salmon fry. The quantification of the bacterial load using qPCR showed to be unsuccessful, probably because the fish had too low bacterial numbers and that the samples were dominated by host DNA. The overall results showed that different strains have various abilities to colonize the mucosal surfaces of salmon yolk-sac fry, and that J. lividum was clearly the “best” colonizer of the skin. This is very interesting since J. lividum have also been found to be a member of the skin of amphibians and even humans, and have shown to exhibit ani-bacterial, anti-fungal and anti-cancer properties.