| dc.description.abstract | Thraustochytrider er heterotrofe protister som under bestemte betingelser akkumulerer store mengder triglyserider som er svært rike på omega-3-flerumettede fettsyrer. Det økende globale behovet for disse fettsyrene har gjort thraustochytrider til særlig lovende kandidater for mikrobiell produksjon av disse.
En forståelse på systemnivå av den metabolske overgangen fra eksponentiell vekst til lipidakkumulering er derimot fortsatt uklar.
Genome-skala metabolske modeller (GSM) muligjør en forståelse på systemnivå av organiseringen og adferden til biokjemiske nettverk. Denne modelleringsmetoden integrerer samtlige metabolske egenskaper til organismen ved bruk av et såkalt støkiometrisk rammeverk som muliggjør den simultane beregningen av samtlige reaksjonshastigheter i hele det metabolske nettverket. Disse cellulære fenotypene bidrar til stor innsikt i egenskapene til det metabolske systemet, og har av nettopp denne grunnen blitt til et av de viktigste verktøyene innen systembiologisk forskning på metabolske systemer. GSM inkorporerer også direkte forbindelser mellom genotyper og biokjemiske fenotyper ved bruk av boolske gen-reaksjon-assosiasjoner, som muliggjør direkte simulering av knockout-strategier for økt målmetabolittproduksjon.
Ved bruk av en allerede publisert GSM av en nært beslektet stamme, ble en GSM av høy kvalitet rekonstruert for thraustochytriden Auranthiochytrium sp. T66. Ved hjelp av iterative modifikasjoner og forbedringer ble det metabolske omfanget og dekningsgraden til modellen utbedret sammenlignet med templatmodellen. Den endelige modellen inneholdt 2093 unike metabolske reaksjoner, 1668 metabolitter, og 1191 tilhørende gener. Simulerte genessensialitetsanalyser på minimalt karbon-medium antydet at det metabolske nettverket er både robust og tilpasningsdyktig, ved å oppnå optimal eller sub-optimal vekst for rundt 81\% av alle gen-knockouter.
Flere doble reaksjonsmutanter ble identifisert ved bruk av OptKnock-algoritmen som resulterte i økte produksjonsrater av de essensielle lipid-forløperne malonyl-CoA og NADPH.
Ved inkorporering av transkriptomdata ble det også oppdaget en sammenfallende nedregulering av spesifikke reaksjonsspor i aminosyremetabolismen ved nitrogen-begrensing, noe som tyder på en konservert reguleringsmekanisme som også er observert i andre oljeholdige mikroorganismer. Den sistnevnte analysen antyder også en bimodal reguleringsmekanisme der fettsyrasyntase-komplekset (FAS) virker å være primært regulert på transkriptomnivå, mens det konkurrerende enzymkomplekset ansvarlig for produksjnoen av de omega-3-flerumettede fettsyrene, polyketid-syntase (PKS), tilsynelatende er regulert på metabolittnivå. Dette kan tyde på at en økning av den intracellulære mengden av lipid-forløperne vil kunne øke aktiviteten til PKS, og i mindre grad påvirke aktiviteten til FAS, som følgelig vil kunne forbedre den fraksjonelle sammensetningen av de ønskede omega-3-fettsyrene i A. sp. T66. | |
| dc.description.abstract | Thraustochytrids are heterotrophic protists that under certain conditions accumulate large quantities of triacylglycerols (TAGs) rich in omega-3 polyunsaturated fatty acids (PUFAs). The increasing global demand for these PUFA-rich TAGs has consequently made the thraustochytrids being regarded as primary candidates for microbial lipid producing cell factories. However, a systems-level understanding of the metabolic shift from exponential growth to lipid accumulation is in a large extent unclear.
Genome-scale metabolic models (GSMs) allow for a systems-level understanding of the organization and behavior of biochemical networks. The modeling approach integrates all the metabolic capabilities of an organisms within a stoichiometric framework, enabling the in silico prediction of the reaction fluxes throughout the metabolic network. The ability to predict cellular phenotypes offers major insights into the properties of metabolic systems, and constraint-based analyses have, for this reason, become one of the most important tools in the systems biological studies of metabolism. GSMs also provide direct correlations between the genotype and biochemical phenotype through boolean gene-reaction associations, allowing for the direct simulation of metabolic engineering strategies.
Using an already published GSM of a closely related strain, a high-quality GSM of the thraustochytrid Auranthiochytrium sp. T66 termed iVS1191 was reconstructed. Through iterative refinements and extensive manual curation, the metabolic scope and coverage of the model was significantly improved from that of the template reconstruction. The generated model consisted of 2093 unique metabolic reactions, 1668 metabolites, and 1191 associated genes. Simulated gene essentiality predictions on carbon-limited minimal medium revealed a robust and adaptable metabolic network, able to grow at sub-optimal or optimal growth phenotypes for around 81\% of all single-gene knockouts. Using the OptKnock algorithm, multiple double-reaction knockout strategies were proposed for the increased production the key lipid precursors malonyl-CoA and NADPH.
Additionally, the integration of genome-wide transcriptomics data indicate a concurrent down-regulation of specific pathways of the amino acid metabolism at the onset of lipid accumulation, alluding to a conserved transcriptional regulation also observed in other oleaginous microorganisms. The latter analysis also suggest a bimodal regulatory mechanism by which the fatty acid synthase (FAS) complex appears to primarily be regulated on the transcriptional level, while the competing polyketide synthase (PKS) pathway, responsible for the biosynthesis of the omega-3 PUFAs, seems to be regulated on the metabolic level. These results suggest that increasing the intracellular pool of lipid precursor might preferentially benefit the flux through the PKS pathway compared the FAS system, thus increasing the fractional amounts of the omega-3 PUFA in A. sp. T66. | |
