Alginate-polycation capsules as microcarriers for cell culture - Preparation and characterization

Abstract

Celler kan miste sin form og funksjon når de blir kultivert på 2D-overflater, som er den nåværende standarden. Derfor kreves bedre kultiveringsmetoder for å få et mer nøyaktig bilde av cellenes oppførsel og interaksjoner. Microbærere har en overflate som strekker seg i 3D, og er en forbedring fra flate petriskåler som også tar mer plass. Alginat er et biokompatibelt materiale som danner en gel når divalente kationer som Ca2+ tilsettes. Kuler med diameter mindre enn 1 mm kan enkelt lages av alginat. Dette biopolymeret har ingen celleadherende egenskaper, og geldannelsen er reverserbar, noe som leder til svelling og oppløsning. For å promotere celleadhesjon og stabilisere kulene mot osmotisk svelling, kan alginatkulene belegges med polykationer som poly-L-lysin (PLL) og kitosan. Disse kan kompleksere med alginat og danner en beskyttende og stabiliserende membran, som også har bedre celleadherende egenskaper. Denne tesen omhandler produksjon og karakterisering av slike microbærende polykation-alginat kapsler. Egenskapene til PLL-belagte og kitosan-belagte alginatkuler ble bestemt. Effekten størrelsen av kulene hadde på stabiliteten ble testet ved en kortvarig svellingsstudie i fysiologisk saltvann. Stabiliteten av kulene i cellekulturmedie ble også testet. Fordelingen av polymerene i kulene ble bestemt ved hjelp av fluorescensmerking av alginat, PLL og kitosan, og avbildning av kulene med konfokal laserskanningsmikroskopi. For fluorescensmerking av kitosan måtte en merkingsmetode utvikles. Til slutt ble det foretatt en celleadhesjonsstudie av kulene for å bestemme om polykation-beleggene induserte celleadhesjon av ankeravhengige celler. Det ble observert at homogen merking av kitosan med lav acetyleringsgrad (FA <0,0002, Mn = 15 kDa) ikke var mulig med de forsøkte metodene på grunn av uløseligheten av kitosanet ved nøytral og høyere pH. Merking av kitosaner med intermediær acetyleringsgrad (FA = 0,48, Mn = 16 kDa) og (FA = 0,52, Mn = 159 kDa) var mulig ved anvendelse av karbodiimidkjemi ved pH = 7,2. Fordelingen av alginat i de PLL-belagte kulene var tydelig inhomogen, med en betydelig akkumulering av alginat ved overflaten. Fordelingen av PLL viste også en høy konsentrasjon på overflaten, som ikke trengte langt inn i kulen, i tråd med tidligere arbeid. Alginatfordelingen i de kitosan-belagte alginatkulene med lav FA <0,0002, viste også en høyere konsentrasjon mot overflaten, men med en slakere netrapping mot midten enn i de PLL-belagte kulene. Det var ingen bilder av fordelingen av kitosanet (FA <0,0002, Mn = 15 kDa), siden fluorescensmerkingen ikke lyktes. Kitosanene med en intermediær FA induserte en mindre inhomogen alginatfordeling. Profilen til kitosansene selv viste en penetrasjon av kulene helt gjennom til kjernen, med en høyere konsentrasjon mot overflaten. Kitosanet med høy molekylvekt viste en langt mer inhomogen fordeling enn lavmolekylært kitosan, i samsvar med Gåserøds arbeid. Størrelsen hadde ingen klar effekt på den osmotiske stabiliteten til kulene i saltoppløsning eller MQ-vann. De kitosanbelagte alginatkulene var stabile i minst 5 dager i cellekulturmedie, mens de PLL-belagte kulene viste gradvis mer innskrumping i dyrkningsmediet over 5 dager. To celleadhesjonsstudier ble utført. Den første ble gjort med Hep G2-celler over 7 dager, og det ble observert at cellene bare festet seg til de kitosan-belagte alginatkulene, og i liten grad. Cellene som festet seg var levende og spredte seg ut på perlene. Når kulturmediet ble endret på dag 3, hadde cellene løsnet fra kulene til dag 4 og adhert igjen til dag 7. I den andre studien ble både Hep G2- og IMR-90-celler dyrket på de kitosan-belagte kulene i 24 timer. IMR-90-cellene viste også kun binding til de kitosan-belagte kulene, men i en enda mindre grad enn Hep G2-cellene. Under cellestudien ble det observert at de kitosan-belagte kulene ble ugjennomsiktige i det første kulturmediet, men ikke når en ny flaske cellekulturmedium ble brukt. Det ble også oppdaget at ethidium homodimer I av Live/Dead-merkingssettet brukt for å fluorescensmerke cellene for avbildning, også merket de kitosan-belagte kulene. Dette kom ikke i veien for observasjonene av cellene, men det ble notert og undersøkt litt nærmere. Det gjennomgående temaet fra observasjonene og problemene som oppsto med de kitosan-belagte kulene var relatert til pH. Både bestemmelsen av distribusjonsprofilen til det deacetylerte kitosanet (FA <0,0002) og cellenes løsning fra kulene når celledyrkningsmediet ble endret, må adresseres i fremtidig arbeid. Mer forsiktig kontroll av mediets pH må vurderes for å opprettholde det samme landingsnivået på overflaten av de kitosan-belagte kulene for å forsøke å unngå at cellene løsner.

Cells cultivated on 2D surfaces, as is the current standard, can lose their morphology and function, meaning that other, better ways of cultivation need to be employed for a better understanding of how cells interact and behave. The 3D scaffold that is microcarriers are an improvement in that respect, in addition to making better use of space. Alginate is a biocompatible material that can easily be made into alginate-gel beads smaller than 1 mm by crosslinking with divalent cations like calcium. Alginate lacks cell adhesive properties, and the crosslinking with divalent cations is reversable, leading to swelling and dissolution of the gel. To promote cell adhesion and to stabilize against osmotic swelling, alginate beads can be coated with polycations like poly-L-lysine (PLL), and chitosan, which forms a polyelectrolyte complex with the electronegative alginate. The addition of these polycations stabilise the beads, and both PLL and chitosan have been showed to have cell adhesive properties. This thesis presents the production and characterisation of these microcarriers made of polycation-coated alginate. The properties of PLL-coated, and chitosan-coated alginate beads was determined. The effect of size on the stability of the beads was tested by a short-term swelling study in saline. The stability of the beads in cell culture media was also tested. The distribution of the polymers in the beads were determined by fluorescently labelling alginate, PLL, and chitosan, and imaging the beads with confocal laser scanning microscopy. For that task, a method for fluorescent labelling of chitosan needed to be developed. Lastly, a preliminary cellular attachment study of the beads was conducted to determine if either bead coating was appropriate for cell adhesion of anchorage dependent cells. It was observed that homogeneous labelling of low acetylation degree chitosan (FA < 0.0002, Mn = 15 kDa) was not possible with attempted labelling methods, due to the insolubility of the chitosan at neutral, and above, pH. Chitosans of intermediary acetylation degree (FA = 0.48, Mn = 16 kDa) and (FA = 0.52, Mn = 159 kDa) were successfully labelled using carbodiimide chemistry at pH = 7.2. The distribution of alginate in the PLL-coated beads was clearly inhomogeneous, with a substantial accumulation of alginate at the surface. The distribution of the PLL also showed a high concentration at the surface, that did not penetrate far into the bead, consistent with previous work. The alginate distribution in the chitosan-coated beads, with low FA < 0.0002, also showed a higher concentration towards the surface, but with a gentler decline towards the centre than in the PLL-coated beads. There were no images of the distribution of the chitosan (FA < 0.0002, Mn = 15 kDa), as the fluorescent labelling was not successful. The chitosans of a more intermediate FA induced a less inhomogeneous alginate distribution. The profile of the chitosans themselves showed a penetration of the beads right through to the core, with a higher concentration towards the surface. The chitosan with the high molecular weight showed a much more inhomogeneous distribution than the low molecular weight chitosan, consistent with the work of Gåserød. Size had no clear effect on the osmotic stability of any of the beads in saline solution or MQ-water. The chitosan-coated beads were stabile for at least 5 days in cell culture media, whereas the PLL-coated beads showed progressively more shrivelling in the culture media over 5 days. Two cellular attachment studies were performed. The first was done with Hep G2 cell for 7 days, and it was observed that the cells only attached to the chitosan-coated beads, and only to a small degree. The cells that attached were alive and spread out on the beads. When culture media was changed on day 3, the cells had detached by day 4, and reattached by day 7. In the second study both Hep G2 and IMR-90 cells were cultured on the beads, and only for 1 day. The IMR-90 cells also showed a small degree of attachment to only the chitosan-coated beads, but less so than the Hep G2 cells. Unexpectedly, the chitosan-coated beads also turned opaque in the first culture media, but not when a new bottle of cell culture medium was used. It was also discovered that the ethidium homodimer I of the Live/Dead kit used to stain the cells for imaging, also stained the chitosan-coated beads themselves. Not enough to cause issues with the observations of the cells, but it was noted and looked into. The recurring theme of the observations and issues that were had with the chitosan-coated beads were related to pH. Both the determination of the distribution profile of chitosan (FA < 0.0002) and the detachment of the cells when cell culture medium was changed need to be addressed in future work. More careful control of the pH of the medium needs to be considered to maintain the same level of charge on the surface of the chitosan-coated beads to try to mitigate the cell detachment that was observed.