Biokonservering - Screening av melkesyrebakterier for inhibering av patogene bakterier i sjømat

Abstract

En endring i mattrendene hos forbruker som innebærer økt etterspørsel etter spiseferdig og lettprosessert sjømat gjør at det kreves nye metoder og kombinasjon av metoder innenfor konservering av sjømat. Biokonservering er en mild og lite utforsket metode for konservering av sjømat. Med biokonservering menes at naturlig forekommende mikroorganismer og/eller deres antimikrobielle metabolitter tilsettes i et produkt i bestemte mengder. Melkesyrebakterier og/eller deres bakteriosiner, bakteriofager og enzymer produsert av bakteriofager kan egne seg godt til biokonservering, men krever at de har blitt testet under relevante betingelser og at det har blitt utført en full screening mot ulike miljøfaktorer og prosesseringsbetingelser før de kan tas i bruk. Slike screeninger vil inkludere blant annet bakterieisolatenes evne til inhibering av forringelsesorganismer eller patogene bakterier, evne til å vokse ved lav temperatur, bidrag til forringelse og kvalitetsendring og hvordan sensoriske egenskaper påvirkes. Denne oppgaven tar for seg inhibering av patogene bakterier, som er første trinn i screeningen.

Hensikten med oppgaven var å skaffe mer kunnskap omkring vekstegenskapene til melkesyrebakterier isolert fra spiseferdige, kjølelagrede sjømatprodukter av røkelaks, sushi og gravlaks, og screene for deres inhiberende egenskaper mot målorganismene Listeria innocua, Escherichia coli og Staphylococcus aureus. Screening etter inhiberende effekter ble gjennomført ved å dyrke melkesyrebakterien i co-kultur med målorganismen i beriket fiskejuice i 96-brønnsplater ved 15 °C. Kvantifisering av vekst ble gjennomført ved spotting (på selektive og generelle medier) som er en effektiv og ressursbesparende metode for å estimere kimtall. Melkesyrebakteriene ble videre identifisert ved hjelp av sekvensering av 16S rRNA ved hjelp av universelle primere.

Totalt 93 av 100 melkesyrebakterieisolater vokste ved 15 °C. Av utvalget på 35 melkesyrebakterieisolater som ble screenet for inhiberende effekt mot L. innocua, E. coli og S. aureus, hadde 19 bakterieisolater (54,3 %) inhiberende effekt mot minimum en av målorganismene og 8 bakterieisolater (22,9%) en inhiberende effekt mot flere enn en målorganisme. En god inhiberende effekt defineres som mer enn 3,0 log reduksjon i kimtall sammenlignet med om målorganismen vokser alene. Bakterieisolat nr. 461 ble identifisert som Carnobacterium sp. og var eneste bakterieisolat med god inhiberende effekt mot alle tre målorganismene. Spotting som kvantifiseringsmetode fungerte optimalt for L. innocua, E. coli og melkesyrebakterier, men spotting av S. aureus krever optimalisering. Fra sekvenseringen ble 29 isolater identifisert som Carnobacterium sp. og 1 Leuconostoc sp. (isolert fra sushi), noe som viser lite variasjon i både slekter og mellom produktene. Det var likevel stor variasjon i henhold til den inhiberende effekten hos Carnobacterium spp. Totalt 19 av 35 melkesyrebakterieisolater har vist god inhiberende effekt mot minimum en målorganisme, og disse vil være aktuelle for videre screeninger.

A change in the food trends of consumers, that include an increased demand for «Ready-to-Eat»- and minimally processed seafood requires new methods and a combination of methods for preservation of seafood. Biopreservation is a mild and unexplored method for preserving of seafood, and usually involves the application of naturally occurring microorganisms and/or their inherent antimicrobial metabolites in a product at certain quantities. Lactic acid bacteria and/or their bacteriocins, bacteriophages and bacteriophage-encoded enzymes may be good candidates, but multiple tests during relevant conditions and a full screening against various environmental factors and processing conditions needs to be done before they can be used. Such screenings will include to check the bacterial isolates ability to inhibit spoilage microorganisms or pathogenic bacteria, the ability to grow at low temperature, contribute to deterioration and quality change and how sensory properties are affected among other things. This study will focus on the inhibition of pathogenic bacteria, which is the first step in the screening process.

The aim of this study was to gain more knowledge about the growth properties of lactic acid bacteria isolated from chilled «Ready-to-eat»-products of smoked salmon, sushi and «gravlaks», and to screen for their inhibitory properties against target organisms. Screening for inhibitory effects was performed by culturing the lactic acid bacteria in a co-culture with the target in enriched fish juice in a 96-well plate at 15 ° C. Quantification of growth was accomplished by spotting (on selected and general media) which is an efficient and resource-saving method for estimating colony count. The lactic acid bacteria were further identified by sequencing of 16S rRNA using universal primers.

A total of 93 of 100 isolates of lactic acid bacterial grew at 15 ° C. Of the selection of 35 lactic acid bacteria isolates screened for inhibitory effect against L. innocua, E. coli and S. aureus, 19 isolates of lactic acid bacteria (54.3%) had inhibitory effect against at least one of the target organisms and 8 isolates of lactic acid bacteria (22.9%) had an inhibitory effect against more than one target. A good inhibitory effect is defined as more than 3.0 log reduction in colony count compared to whether the target organism grows alone. Bacterial isolate No. 461 was identified as Carnobacterium sp. and was the only bacterial isolate with good inhibitory effect against all three target organisms. Spotting as a quantification method worked optimally for L. innocua, E. coli and lactic acid bacteria, but spotting of S. aureus requires optimization. From the sequencing, 29 isolates were identified as Carnobacterium sp. and 1 Leuconostoc sp. (isolated from sushi), which shows little variation in both genera and between products. However, there was big variation according to the inhibitory effect of Carnobacterium spp. A total of 19 lactic acid bacterial isolates have shown good inhibitory effect against at least one target organism and these will be relevant for further screening.