Enzymatic protein hydrolysis of residual raw materials from poultry - A study of proteases’ selectivity toward collagen and myofibrillar proteins

Abstract

Restråstoff fra fjørfeindustrien har en kompleks sammensetning av næringsstoffer som ikke blir fullstendig utnyttet i dagens enzymatiske proteinhydrolyseprosesser. Hovedmålet med denne masteroppgaven var å studere aktiviteten til ulike proteaser ved hydrolyse av restråstoff fra fjørfe for å undersøke ulike proteasers selektivitet for kollagen og myofibrillære proteiner.

For å oppnå en normalisert aktivitet av alle proteaser ble aktiviteten målt opp imot det uspesifikke substratet Azo-Casein. Det ble utviklet en metode for enzymatisk proteinhydrolyse i liten skala for å screene de ulike proteasenes nedbrytning av fire forskjellige restråstoff fra fjørfe: Akilles sener fra kalkun, lårbein av kylling, kyllingkjøtt og restene etter mekanisk utbeining av kylling, også kalt kyllingskrog. Basert på forholdet mellom nedbrutt mengde av Akilles sener og kyllingkjøtt ble de to proteasene Bromelain og Endocut-02 valgt ut for videre vurdering. Disse proteasene ble igjen testet i liten skala, men denne gangen med duplikater og tidsuttak, samt i en oppskalert versjon av hydrolysen for å studere om metodene og proteasene ga reproduserbare resultater med mulighet for oppskalering. Her ble det i tillegg laget en egen versjon av kyllingskroget med kontrollert sammensetning bestående av en tredjedel av sener, kjøtt og bein fra kylling. Hydrolysatene ble analysert med Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) og size exclusion chromatography (SEC). FTIR ble brukt for å studere degraderingen av peptidbindinger under hydrolysen og dannelsen av terminale amino (NH3+) og karboksyl (COO-) grupper, mens SEC ble gjennomført for å karakterisere sammensetningen av peptider i hydrolysatene.

Hydrolyse i både liten og oppskalert skala viste at Bromelain hadde den største nedbrytningen av Akilles sener (24.4 and 39.9 %) og kyllingkjøtt (36.7 and 42.8 %), mens Endocut-02 hadde en større nedbrytning av de mer komplekse restråstoffene som kyllingskrog (24.8 and 44.6 %) og den egenkomponerte versjonen av kyllingskrog (10.2 and 20.0 %). Bromelain hadde derimot større nedbrytning enn Endocut-02 av sistnevnte råstoff i den oppskalerte hydrolysen (30.6 %). En økning i utbytte ble observert ved oppskalering av hydrolysen, mens distribusjonen av molekylvekt var omtrent lik i hydrolysat produsert fra samme restråstoff i både liten og oppskalert skala. Denne kunnskapen kan være nyttig for videre utvikling av den fremtidige flertrinnsprosessen av restråstoff fra fjørfe som forhåpentligvis kan føre til fullstendig utnyttelse av råstoffet samt økt verdiskapning for industrien.

Residual raw materials from the poultry industry have a complex composition of nutrients which are not completely utilized in the current enzymatic protein hydrolysis (EPH) industry. The main aim of this master thesis was to study several proteases’ activities towards hydrolysis of residual raw materials from poultry to search for proteases with high selectivity towards collagen and/or myofibrillar proteins.

Measurements of the proteases’ activities towards the nonspecific protease substrate Azo-Casein was conducted to obtain normalized activities for all proteases. A small-scale EPH methodology was developed and evaluated, aiming to screen the proteases’ digestion of four different poultry residual raw materials: Achilles tendons of turkey, chicken leg bone, chicken meat, and mechanically deboned chicken residue (MDCR). Based on the ratio of digested Achilles tendons and chicken meat, the two proteases Bromelain and Endocut-02 were chosen for further studies. These proteases were tested in a small-scale hydrolysis with duplicates and time points, and in a upscaled hydrolysis to study the methods’ and proteases’ reproducibility and scalability of hydrolysis. In these experiments, an artificial MDCR consisting of one-third of tendons, meat and bones was also included. All obtained hydrolysates were analyzed by Fourier-transform infrared spectroscopy (FTIR) and size exclusion chromatography (SEC). FTIR was used to study the degradation of peptide bonds during hydrolysis and the formation of terminal amino (NH3+) and carboxyl (COO-) groups, while SEC was conducted for characterization of the hydrolysates’ peptide composition.

Hydrolysis in both small-scale and upscale showed that Bromelain had the highest digestion of Achilles tendons (24.4 and 39.9 %) and chicken meat (36.7 and 42.8 %), while Endocut-02 had a greater digestion of the more complex residual raw materials as MDCR (24.8 and 44.6 %) and artificial MDCR (10.2 and 20.0 %). However, Bromelain had a higher digestion than Endocut-02 of the artificial MDCR in the upscaled hydrolysis (30.6 %). An increase in yield was observed with upscaling of hydrolysis, while the molecular weight distributions were quite similar in hydrolysates obtained from the same raw material in both small-scale and upscale. The obtained knowledge could be of importance for further development of the future multistep processing of residual raw materials of poultry, possibly leading to complete utilization of the raw material and value creation for the industry.