Show simple item record

dc.contributor.advisorHaug, Markus
dc.contributor.advisorSelbo, Pål Kristian
dc.contributor.authorFrom, Miriam Rosvold
dc.date.accessioned2019-09-06T14:02:41Z
dc.date.available2019-09-06T14:02:41Z
dc.date.issued2019
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11250/2613198
dc.description.abstractGallegangskreft er en type kreft med svært dårlig prognose på grunn av dens aggressivitet og motstand mot forskjellige behandlinger. I dag er kirurgi den eneste kuren, men majoriteten av pasienter diagnostiseres for sent til at tumoren kan fjernes kirurgisk. Pasienter med inoperabel kreft har en kort median overlevelse (11.7 måneder), og cellegift brukes i hovedsak som lindrende behandling. Det er derfor et stort behov for bedre og mer spesifikke behandlingsmetoder for å kunne øke denne pasientgruppens overlevelsesrate. Dagens bruk av cellegift er ofte begrenset av medisinens alvorlige bivirkninger på friskt vev. Hvis forholdet mellom cellegift i tumor og cellegift i friskt vev økes, kan bivirkningene reduseres. En måte å oppnå dette på er administrering av cellegift ved hjelp av nanopartikler, noe som har vist seg å føre til økt oppsamling av cellegift i tumor. Dessverre har nanopartikler vist seg å ha en begrenset toksisk effekt etter oppsamling i tumorvevet. En mulig løsning på dette er å administrere cellegift til pasienter i kombinasjon med fotokjemisk internalisering (PCI). PCI er en ny teknologi hvor man kombinerer et fotokjemisk molekyl (PS), lys og oksygen for å øke oppsamlingen av medisiner og partikler, som tas opp gjennom endosomer og lysosomer, i cellenes cytosol. På den måten vil medisin, som da er sluppet ut av nanopartiklene, bli frigjort fra endosomene og lysosomene, og diffundere ut i cellens cytosol. Medisinen kan da lokalisere seg i organellene hvor den skal utøve sin cytotoksiske effekt. Caelyx® er en klinisk godkjent liposomal nanomedisin, og baserer seg på virkemiddelet doxorubicin. Nanomedisinen har vist seg å redusere alvorlige bivirkninger samtidig som den øker oppsamlingen av doxorubicin i tumor in vivo. Til tross for dette har Caelyx® ikke økt den kurerende effekten i forhold til fri doxorubicin. Det er blitt foreslått at denmanglende effektiviteten er grunnet opphoping av Caelyx® i endosomer og lysosomer uten at medisinen da slippes ut, noe som hindrer medisinen fra å nå sitt intracellulæremål (kjernen). Bruk av PCI kan kanskje frigjøre Caelyx® som har blitt fanget i endosomer og lysosomer, og dermed øke medisinens effektivitet. Målet for denne oppgaven er derfor å teste om effekten av Caelyx® kan økes i galeganskreftceller ved hjelp av PCI. I denne oppgaven har en in vitro protokoll for testing av den cytotoksiske effekten til Caelyx® i kombinasjon med PCI blitt videreutviklet og optimalisert for galleganskreft-cellelinjene EGI-1 og TFK-1. Den optimale Caelyx®-konsentrasjonen og inkubasjonstiden etter lyseksponering ble bestemt for begge cellelinjene, og liposomene i nanomedisinen Caelyx® viste seg å være stabile forbimedisinens utløpsdato. Videre viste konfokal laserskanningmikroskopi at doxorubicin (muligens Caelyx®) og PS’en TPCS2a samlokaliserte til granulære strukturer somlignet endosomer og lysosomer. Effekten av PCI med Caelyx® ble vurdert ved bruk av tre forskjellige analyser: metabolsk aktivitet (MTS), ATPinnhold i levende celler og LDH-utslipp fra døde celler. Både MTS- og ATP-analysene indikerte at celler behandlet med PCI med Caelyx® hadde en økt cytotoksisk effekt i forhold til kun Caelyx® og kun fotodynamisk behandling (PDT = PS og lysbehandling uten tilsatt cellegift). Derimot ser det ut til at den oppnådde cytotoksiske effekten av PCI skyldes en additiv effekt av PDT-indusert cellulær skade og PCI-frigjørelse av Caelyx®, noe som fører til at den ønskede synergi-effekten av PCI ikke oppnås. Mangelen på en synergi-effekt kan skyldes en uventet økt cytotoksisitet av kun Caelyx® i PCI-eksperimentene; en økning som ikke var tilstede da den optimale Caelyx®-konsentrasjonen ble bestemt. Den økte cytotoksisiteten kan være på grunn av uheldige dyrkingsforhold, noe som kan ha oppstått under inkubasjon av cellene i aluminiumsfolie. Videre testing av PCI med Caelyx®, hvor cellene ikke inkuberes i aluminiumsfolie, er derfor nødvendig. For å undersøkemulige celledødsmekanismer av PCI med Caelyx®, ble caspase 3/7 aktivitet, ekstracellulær fosfatidylserin (ved annexin V-farging) og ekstracellulær calreticulin (CALR) målt. Analyse av caspase 3/7 og annexin V indikerte at få celler gjennomgikk apoptose på de målte tidspunktene som en respons til PCI av Caelyx®, mens CALR-analysen viste at begge cellelinjene ser ut til å aktivere immunogen celledød. Flere studier trengs derimot for å avgjøre de nøyaktige celledødsmekanismene i PCI-behandlede celler. Den høye cytotoksiste effekten av PCI med Caelyx® funnet i denne oppgaven er oppløftende, men videre studier er nødvendige for å sikkerhet kunne si at PCI kan føre til økt cytotoksisk effekt av Caelyx®.
dc.description.abstractCholangiocarcinoma (CCA), more commonly known as bile duct cancer, is a cancer with very poor prognosis due to its aggressive and therapy resistant nature. The only current curative treatment for CCA is surgery. However, the majority of patients are diagnosed too late, resulting in inoperable tumors. CCA patients with unresectable tumors have a short median survival (11.7 months), where chemotherapy is mainly used as palliative treatment. There is therefore a crucial need for more efficient and specific treatment modalities to improve the outcome of this patient group. The current use of anticancer drugs is often limited by adverse drug reactions causing toxicity to normal tissues. However, if the ratio between accumulation of chemotherapeutic drug in tumor and normal tissue is increased, the curative effect can be improved, while the toxicity to normal tissue is decreased. Delivery of a chemotherapeutic drug in a nanoparticle formulation promotes accumulation of the drug in tumor tissue, reducing side effects, but may have limited intracellular delivery once in the tumor tissue. A promising strategy to further increase drug delivery effectivenessmight therefore be the delivery of nanoparticle formulations to tumor cells by photochemical internalization (PCI). PCI is a novel technology, where the combination of a photosensitizer (PS), light and oxygen is used to enhance delivery of a drug or particle entrapped in endosomes to the cytosol of cells. Drug released from nanoparticles are thereby released from endosomal compartments into the cytosolic space, fromwhere it can effectivelymediate its cytostatic effect. Caelyx® is a clinically approved liposomal nanoparticle medicine with doxorubicin as the active agent, and is currently undergoing clinical investigations for the treatment of CCA. The nanoparticle formulation has proven to diminish severe side effects and increase doxorubicin accumulation in the tumor tissue in vivo. However, in clinical trials, Caelyx® has not been found more effective than free doxorubicin. It has been suggested that the lack of cytotoxic effect is due to entrapment of Caelyx® in endosomes and lysosomes, preventing the active agent from reaching its intracellular target. Release of endosome-entrapped Caelyx® into the cytosolic space of tumor cells might be achieved by PCI. The aim for the current thesis was therefore to test if delivery of Caelyx® in CCA cells using PCI can improve the cytotoxic effect of Caelyx®. In this thesis, an in vitro experimental protocol for testing the cytotoxic effects of Caelyx® in combination with PCI on the CCA cell lines EGI-1 and TFK-1, has been developed and optimized. The optimal Caelyx® concentration and incubation time after light exposure was determined for the EGI-1 and TFK-1 cell lines. Additionally, the stability of the liposome formula in Caelyx® was evaluated and found to be stable even past the expiration date. Confocal laser scanning microscopy revealed that doxorubicin (possibly Caelyx®) and the PS TPCS2a co-localized in granular structures resembling endosomes and lysosomes. PCI-mediated cytotoxicity of Caelyx® was assessed by three different assays: metabolic activity (MTS), ATP content in viable cells and LDH release from dead cells. Both the MTS and ATP assay indicated that cells treated with PCI of Caelyx® experienced a higher cytotoxicity than Caelyx® alone and photodynamic treatment (PDT = PS and light treatment in the absence of cytostatic drug) alone. However, the PCI effect appears to be a combination of PDT-induced cellular damage and Caelyx®, resulting in no synergistic effect of PCI. The lack of synergy is speculated to arise due to an unexpected increased cytotoxicity of Caelyx® alone in experiments evaluating the effect of PCI of Caelyx®, which was not seen when the optimal Caelyx® concentration was established. The increased cytotoxicity was possibly caused by unfavorable culture conditions due to incubated in light-preventing aluminum foil. Further testing of PCI-mediated release of Caelyx® without aluminumfoil is therefore necessary. In order to investigate possible cell death mechanisms initiated by PCI of Caelyx®, caspase 3/7 activity, extracellular expression of phosphatidylserine (annexin V staining) and extracellular calreticulin (CALR) expression was measured. Analysis of caspase 3/7 activity and annexin V staining indicated that few cells underwent apoptosis in response to PCI of Caelyx®, while CALR analysis post PCI treatment indicated that both cell lines underwent immunogenic cell death. However, further studies are needed to determine the exact cell death mechanisms in PCI-treated CCA cells. This is the first study evaluating the PCI-technology in combination with the clinically approved nanomedicine Caelyx®. The high cytotoxicity seen for PCI of Caelyx® is therefore encouraging, and warrant further evaluation of PCI of Caelyx®, not only on CCA cells, but also on other cancer types, to establish if PCI can improve the cytotoxic effect of Caelyx®.
dc.languageeng
dc.publisherNTNU
dc.titleEvaluation of photochemical internalization of Caelyx in cholangiocarcinoma cell lines
dc.typeMaster thesis


Files in this item

FilesSizeFormatView

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record