Karakterisering av overflateproteiner på ekstracellulære vesikler fra humane monocytter ved bruk av magnetiske kuler og flowcytometri

Abstract

Det overordnede målet for denne oppgaven er å karakterisere overflateproteinene tissue factor, CD9 og CD81 på ekstracellulære vesikler som er isolert fra monocytter. Det anvendes en metode som benytter flowcytometri og magnetiske kuler for å påvise disse overflateproteinene. Denne metoden er tidligere ikke benyttet for å påvise tissue factor, og hovedmålet med denne oppgaven er derfor å finne ut om det er mulig å påvise tissue factor ved bruk av denne metoden. Det undersøkes også om CD9, CD81 og tissue factor finnes både på mikrovesikler og eksosomer fra monocytter, og om stimulering med lipopolysakkarid påvirker mengden overflateproteiner på de ekstracellulære vesiklene. I denne oppgaven anvendes det også to ulike metoder for proteinkvantitering (Qubit-metoden og BCA-metoden), og det undersøkes hvilken av disse metodene som er best egnet til kvantitering av ekstracellulære vesikler fra monocytter.

Prøvematerialet som benyttes både til påvisning av overflateproteiner og til proteinkvantitering er isolerte eksosomer og mikrovesikler fra monocytter, både med og uten stimulering av lipopolysakkarid. Påvisning av overflateproteiner utføres ved bruk av et flowcytometer, og det benyttes magnetiske kuler konjugert med antistoff til å trekke ut de ekstracellulære vesiklene. Tilsetting av antistoff som er konjugert med et fluorokrom og rettet mot proteinet som skal påvises, muliggjør deteksjonen av det aktuelle overflateproteinet. Når det gjelder proteinkvantitering benytter Qubit-metoden fluorescensmåling, mens BCA-metoden benytter absorbansmåling.

Resultatene fra forsøkene indikerer at det er mulig å påvise tissue factor ved bruk av flowcytometri og magnetiske kuler konjugert med antistoff. Når det tas hensyn til mengde ekstracellulære vesikler i prøvene tyder resultatene på at det er større konsentrasjon av tissue factor, CD9 og CD81 på mikrovesikler enn eksosomer. Resultatene gir også indikasjoner på at stimulering av monocyttene med lipopolysakkarid fører til større mengde tissue factor på overflaten av de ekstracellulære vesiklene, men resultatene tyder ikke på at stimuleringen fører til større konsentrasjon av CD9 eller CD81 på vesiklene. Det er knyttet usikkerhet til om BCA-metoden og Qubit-metoden er egnet til å kvantitere proteiner i løsninger med ekstracellulære vesikler, da ingen av metodene klarte å detektere proteinkonsentrasjonen i løsningen med mikrovesikler som stammet fra monocytter stimulert med lipopolysakkarid. Resultatene gir likevel indikasjoner på at BCA-metoden er mer sensitiv enn Qubit-metoden, i den forstand at den detekterer en høyere proteinkonsentrasjon i prøvene.

The general aim of this thesis is to characterize the surface proteins called tissue factor, CD9 and CD81, found on extracellular vesicles isolated from monocytes. Detection of tissue factor by using a method that uses magnetic balls and flow cytometry has not been previously tested, and therefore the main aim of this thesis is to find out if it is possible to detect tissue factor using this method. Furthermore, this thesis examines whether CD9, CD81 and tissue factor can be found on both microvesciles and exosomes, and whether stimulation of monocytes with lipopolysaccharide affects the amount of surface proteins on extracellular vesicles. In addition, two different methods for quantitation of proteins are performed (the Qubit-method and the BCA-method), and this thesis examines which of these methods is best suited to quantitate extracellular vesciles from monocytes.

The study uses exosomes and microvesicles isolated from monocytes as test material, and some of the test material is stimulated with lipopolysaccharide. Detection of the surface proteins is performed using a flow cytometer, and magnetic balls conjugated with antibodies are used to extract the extracellular vesicles. Addition of antibodies conjugated with fluorochromes and directed against protein of interest, permits detection of the protein of interest. When it comes to quantitation of proteins, the Qubit method uses detection of fluorescense, while the BCA method uses detection of absorbance.

The results from the experiments indicates that it is possible to detect tissue factor using flow cytometry and magnetic balls conjugated with antibodies. When the amount of extracellular vesciles is taken into account, the results indicates that there is a higher concentration of tissue factor, CD9 and CD81 on microvesicles than exosomes. Furthermore, the results suggests that stimulation of the monocytes with lipopolysaccaride causes a greater amount of tissue factor on the extracellular vesicles, but the results do not indicate that stimulation with lipopolysaccaride causes a higher concentration of CD9 nor CD81 on the vesicles. Neither the BCA method nor the Qubit method managed to quantitate proteins in the solution with microvesicles isolated from monocytes stimulated with lipopolysaccharide. Therefore, it is uncertain whether the BCA – and the Qubit method is suited for quantitating proteins. Nevertheless, the results indicates that the BCA method is more sensitive than the Qubit method, as the BCA method detects a higher concentration of extracellular vesicles in the test material.