Holdbarhetsstudie av celler (leukocytter) i bronkialskyllevæske (BAL)

Abstract

Bronkialskyllevæske også kjent som “bronchoalveolar lavage”/BAL) har hatt økende aksept som prøvemateriale når det gjelder diagnostisering og overvåking av diverse lungesykdommer særlig interstitielle lungesykdommer (ILD). Mye av dette skyldes det at BAL er lett å gjennomføre, trygg og godt-tolerert av pasientene. Riktig identifisering og telling av inflammatoriske cellene (leukocytter) i BAL prøver gir BAL sin diagnostiskverdi. Dette strengt foruretsetter opprettholdelse av god stabilitet/levedyktighet av disse cellene under bestemte oppbevaringsvilkår etter prøvetaking. Det fysiologiske saltvannet som brukes til å skylle distale luftveiene og alveolene har lav pH og er fattig på næringsstoff som proteiner og lipider. Dette betyr at celler holder seg dårligere i BAL sammenlignet med naturlig kroppsvæsker under bestemte oppbevarings forhold, siden cellemembranene lettere går i oppløsning ved.lav konsentrajon av lipider og proteiner.

I fagmiljøet er det begrenset kunnskap om holdbarheten til celler i BAL prøver oppbevart i rom- og/eller kjøleskaps temperatur. Dette gjør det vanskelig å standardisere prosedyre for behandling av BAL prøver. Til tross for dette er det overraskende få studier på hvordan holdbarheten av BAL cellene endrer seg på en temperatur- og tidsavhengig måte. Dette forskningsprosjektet har som hovedmål å kartlegge holdbarhet til celler fra BAL, ved å utføre celletelling i BAL prøver oppbevart både i rom- og kjøleskaps-temperatur ved hhv. 1, 2, 4 og 24 timer etter prøvetaking. Det var også ønskelig å finne ut om fargekvaliteten var like god uavhengig av henstandstid og oppbevarings temperatur. For å få til dette ble det utført total celletelling av leukocytter på ADVIA 2120i og differensial celletelling av leukocytter farget med May Grunwald Giemsa (MMG) og mastfarging ved hjelp av cytosentrifugeringsmetode og mikroskopi.

Analyseresultatene fra automatisert telling av totalt antall leukocytter (WBCP og WBCB) tyder på at Leukocytter var stabile opptil 4 timers henstand både i romtempererte og kjøleskap-prøver. Observasjoner fra mikroskopi viste uttalte desintegrajon av cellene i prøver oppbevart i romtemperatur, en utvikling som virket til å ha blitt dempet ved nedkjøling av prøver i kjøleskaps temperatur. Etter 24 timers henstand i romtemperatur ble det observert dårlig fargekvalitet på cellene i for av fargeflekker og variasjon i fargeintensitet (hyper- og hypokromasi). Basert på kvalitetskravene virket makrofager til å klare seg fint opptil 24 timers henstand mens lymfocytter så ut til å være stabile opptil 2 timer. Det ble ikke trukket noen empiriske konklusjoner på grunn av ikke-tilstrekkelig populasjonsstørrelse. I tillegg bestod populasjonen av en overvekt av prøver med lave celle-konsentrasjoner der telle-usikkerheten er stor. Fremtidige holdbarhetsstudier anbefales til å ha populasjonsstørrelse på opptil 40 prøver, hvor en bør inkludere prøver med relativt høyere måleverdier (ca. 0,2 * 109/L) og flere henstandstider særlig mellom 4 og 24 timer.

The use of bronchoalveolar lavage (BAL) as sample material for diagnostic and monitoring of several lung diseases has been on steady in the past few decades. This has mainly been attributed to the fact that BAL is easy to perform, safe and well tolerated by patients. The diagnostic value of BAL is dependent on proper identification and counting of leucocytes in BAL samples which is consequently totally dependent on maintenance of cellular stability/viability under given storage conditions. In comparison with natural body fluids like blood plasma, the physiological saline water in which leucocytes are suspended is unfit as storage medium for cells. This is because of it has lower pH and low content of nourishment (protein, lipids and electrolytes). Cells in BAL samples are therefore thought to have limited stability/viability.

Generally, there is limited information about the stability of cells in BAL samples stored at room and fridge temperature. This has made the standardization of pre-analytical steps for sample treatment of BAL quite challenging. Despite this scarcity of knowledge, there are surprisingly few clinical stability studies of how cells in BAL samples are affected by storage temperature and standing time. The main objective of this stability study is to investigate the stability of cells in BAL samples after 1, 2, 4 and 24 hours` storage at both room and fridge temperature. Additionally, the quality of May Grunwald Giemsa (MMG) and mast cell-staining would also be evaluated. This was achieved by performance of a total cell-count of leucocytes with ADVIA2120i and a differential cell-count of MGG- and mast stained cells via cyto-sentrifugation and microscopy.

The results from automated total cell count (WBCP and WBCB) suggest that leucocytes were stable in a period approaching 4 hours under storage at both rom and fridge temperature. Observation of moderately to severely deformed cells in BAL samples stored at room temperature for 24 hours suggested poor sample quality at these specific storage conditions. However, the degree of cellular deformation was less in samples stored at fridge temperature compared to samples stored in room temperature, which suggested that cooling down BAL samples could probably have a positive effect on cell stability. The quality of MGG and mast cell staining seemed to be compromised in samples stored at room temperature for prolonged periods of time (24 hours). This was based on the increased observation of color stains and variation in color intensity (hyper and hypo-chromicity) in samples stored at room temperature for 24 hours. Based on quality criteria, macrophages seemed stable up to 24 hours storage, while lymphocytes seemed to be stable only up to 2 hours. No empirical conclusions were drawn in this study about the stability of cells in BAL samples. This was mainly due to a small sample size and the presence of large number of samples with low cell count which consequently led to low precision in measurements (data). Future studies would be recommended to have sample size of up to 40 samples and more time-intervals between sampling and analysis especially between 4 and 24 hours.