Optimisation and validation of RT-qPCR assay for relative quantitation of reference genes and stress related regulatory genes in CHSE-214 cells

Abstract

Å forbedre forståelsen rundt effektene av korttids- og langtidsstress har på in vitro celler, kan gi et bedre bilde på de fysiologiske følgene i levende laks. I denne tesen ble en RT-qPCR metode for normalisering av to referansegen, EF1Aa og EF1Ab, og genekspresjonen til HSP70 og p38 MAPK i varmestressede CHSE-214 celler etablert. En metode for RT-qPCR ekspresjonsstudier av CHSE-214 celler ble optimalisert, og EF1Aa og EF1Ab ble validert som passende referansegen. Stabiliteten til referansegenene var innenfor akseptable rammer, mellom 1.187 and 0.382 ganger uttrykksendring. Primer og probekonsentrasjonene for de to referansegenene ga reproduserbare resultater. En RT-qPCR metode ble etablert for HSP70 og p38 MAPK, for å verifisere varmestress responsen. HSP70 transkripsjonen økte betraktelig, og nådde en topp etter 2-4 timer for så å falle under opprinnelig nivå etter 16 timer. Ekspresjonen av p38 MAPK var relativt stabil uten klare trender, som indikerer at p38 MAPK ikke er aktivt regulert under de gitte forholdene.

Understanding how short and long-term stress affects salmonid cells in vitro, may help understanding the physiological effects in live salmon. In this thesis a RT-qPCR method for normalisation of two reference genes, EF1Aa and EF1Ab, and the gene expression profiles of HSP70 and p38 MAPK during the heat stress response of CHSE-214 cells was established A method for RT-qPCR expression studies of CHSE-214 cells was optimised, and EF1Aa and EF1Ab were validated as suitable reference genes. Reference gene stability was demonstrated to be within acceptable bounds, between 1.187- and 0.382-fold expression change. Primer and probe concentration for the two reference genes yielded reproducible results. A RT-qPCR method was established for HSP70 and p38 MAPK to verify a heat shock response. HSP70 expression increased considerably, peaking at 2-4 hours and then returned to baseline expression levels after 16 hours. Expression of p38 MAPK was relatively stable without any peaks of interest, indicating that p38 MAPK does not differentially express under given conditions.