Preventing atopic dermatitis with probiotic supplementation - the role of selected breast milk components: The Probiotics in the Prevention of Allergy among Children in Trondheim (ProPACT) study

Abstract

Probiotika i forebygging av atopisk eksem - rollen til utvalgte morsmelk faktorer Probiotikatilskudd i siste del av svangerskapet og de første levemåneder forebygger utvikling av atopisk dermatitt hos barn. Denne effekten har blitt observert i samlestudier som har undersøkt probiotikatilskudd i forebygging av eksem. Dette til tross for mange ulikheter mellom de randomiserte kontrollerte studiene. Likevel er de biologiske mekanismene bak den forebyggende effekten ukjent. Dette doktorgradsarbeidet undersøker rollen til probiotika og utvalgte morsmelk faktorer i forebygging av atopisk eksem ved å benytte morsmelksprøver innsamlet under studien - «the Probiotics in the Prevention of Allergy among Children in Trondheim (ProPACT) study». Gravide kvinner ble rekruttert til ProPACT, randomisert til å få et kommersielt tilgjengelig syrnet melkeprodukt (Biola®) som inneholder tre probiotiske bakteriearter, eller syrnet placebo melk, fra svangerskapsuke 36 til 3 måneder etter fødselen. Biola® inneholder Lactobacillus rhamnosus GG (LGG), Lactobacillus acidophilus La-5 (La-5) og Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb-12 (Bb-12). Ved to års alder ble det påvist ca. 40 % reduksjon i den kumulative forekomsten av atopisk eksem i probiotikagruppen sammenliknet med placebogruppen. Morsmelk gir først og fremst ernæring og væske til nyfødte barn, men morsmelk beskytter også mot sykdomsfremkallende mikrober, og anses å ha langvarige helseeffekter fordi morsmelken påvirker etableringen av mikrobene i tarmen (tarmmikrobiota) og utviklingen av mage/tarm- og immunsystemet. Blant faktorene i morsmelk som kan bidra til langvarige immunologiske effekter er mikrober assosierte med amming (undersøkt i Paper I), cytokiner og vekstfaktorer (Paper II) og det nylig beskrevne mikroRNA (miRNA; Paper III). De overordnede målene i denne avhandlingen var å undersøke om probiotikatilskudd til mor påvirket disse morsmelk faktorene, og om de bidro til den forebyggende effekten av probiotika mot atopisk eksem som ble observert i ProPACT studien. Alle tre artiklene benytter morsmelksprøver som ble innsamlet fra deltagende kvinner i ProPACT studien ved 10 dager og 3 måneder. I artikkel I, undersøkte vi om de tre probiotiske bakteriene kunne påvises i morsmelk, og om mikrobesammensetningen i morsmelken hadde blitt påvirket. Kun 10 av 472 morsmelksprøvene inneholdt de gitte probiotiske bakteriene og mikrobesammensetningen var uendret hos mødrene som fikk probiotikatilskudd. Om probiotiskatilskudd påvirket konsentrasjonen av cytokinene tymisk stromal lymphopoietin (TSLP) og transformerende vekstfaktorer ß1 (TGF- ß 1), TGF- ß 2, og TGF- ß3 ble undersøkt i artikkel II. Nivået av TSLP 10 dager etter fødsel viste en tendens til å være høyere blant kvinnene i probiotikagruppen, men dette så ikke ut til å ha bidratt i betydelig grad i den forebyggende effekten probiotika hadde mot eksem. Konsentrasjonene av TGF- ß1, TGF- ß2, og TGF- ß3 var ikke forskjellig mellom gruppene 10 dager og 3 måneder etter fødselen, og det var heller ikke forskjeller mellom gruppene mht. TSLP ved 3 måneder. I artikkel III undersøkte vi miRNA profilen 3 måneder etter fødsel i en undergruppe av deltagende kvinner (n = 54). Vi fant en gruppe med 5 miRNA som var høyt uttrykt i alle prøvene. Funksjonelle analyser av predikerte mål mRNA antydet et bredt spekter av potensielle biologiske effekter. Ingen individuelle miRNA viste en overbevisende sammenheng med hverken probiotisktilskudd eller utvikling av atopisk eksem. Oppsummert; vi fant at tilskudd av LGG, La-5 og Bb-12 i 4 måneder til mor hadde minimal effekt på tilstedeværelsen av disse bakteriene i morsmelken. Det var også minimal effekt på konsentrasjonene av TLSP og tre ulike TGF- ß og det relative uttrykket av miRNA i morsmelk. Amming resulterte ikke i nevneverdig overføing av de gitte bakteriene og ingen av de undersøkte morsmelkfaktorene syntes å ha bidratt i betydelig grad i forebyggingen av atopisk eksem. Imidlertid kan probiotika gi en forbigående økning i nivået av TSLP i morsmelk. Resultatene i artiklene I, II og III gir innsikt i sammensetningen av morsmelk, spesielt med hensyn til mikrobesammensetningen i morsmelk og miRNA profil.

Summary Probiotic supplementation during the later stages of pregnancy and during the first months of life prevents the development of atopic dermatitis in infancy. This effect has been observed in meta-analyses despite the use of differing bacterial strains and administration regimes across randomised controlled trials. However, the biological mechanisms behind this effect are incompletely understood. This doctoral work investigated the contribution of selected breast milk components to the preventative effect of probiotics using samples collected during one of the published randomised controlled trials - the Probiotics in the Prevention of Allergy among Children (ProPACT) trial. In the ProPACT trial, women were randomised to receive a commercially available fermented milk containing three probiotic bacterial strains (Biola®), or a placebo fermented milk, from 36 weeks gestation until 3 months after birth. Biola® contains Lactobacillus rhamnosus GG (LGG), Lactobacillus acidophilus La-5 (La-5) and Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb-12 (Bb-12). At 2 years of age, the cumulative incidence of atopic dermatitis was approximately 40 % lower in the probiotic arm of the ProPACT trial. The primary role of breast milk is to nourish and hydrate newborn infants. However, breast milk also provides protection against pathogens and is considered to have long lasting health consequences due its early influence on the establishment of the intestinal microbiota and developing gastrointestinal and immune systems. Among the breast milk components implicated in the long-term immunological effects of breast milk are the breastfeeding-associated microbiota (assessed in Paper I), cytokines and growth factors (Paper II), and the more recently described microRNAs (Paper III). The overriding aims of the papers presented in this thesis were to assess if maternal supplementation had influenced each of these breast milk components, and if they may have mediated the observed preventative effect of the ProPACT regime on the development of atopic dermatitis in infants. The breast milk samples analysed in all three presented papers were collected from women participating in the ProPACT trial at 10 days and 3 months postpartum. In Paper I, we assessed if breastfeeding was a source of the administered bacteria and if the general breastfeeding associated microbiota was affected by probiotic supplementation. The administered bacteria were only recovered in 10 of 472 breast milk samples and the breastfeeding-associated microbiota was unaltered. The influence of probiotic supplementation on the breast milk concentrations of thymic stromal lymphopoietin (TSLP) and transforming growth factor-ß1 (TGF- ß1), TGF- ß2, and TGF- ß3 were assessed in Paper II. Whilst TSLP levels at 10 days postpartum tended to be higher among women in the probiotic arm of the trial, this does not appear to have significantly contributed to the preventative effect of probiotics. The concentration of TGF-ß isotypes did not differ between the probiotic and placebo groups at either time point, nor did TSLP at 3 months. In Paper III, we assessed the microRNA profile at 3 months postpartum in a subgroup of women in the ProPACT trial (n = 54). We observed a group 5 miRNAs that were highly expressed in all samples, and functional analysis of predicted targets suggested a broad range of potential biological consequences. No individual miRNA was convincingly associated with either probiotic supplementation or the development of atopic dermatitis. In conclusion, we found that a four-month period of supplementation with LGG, La5 and Bb-12 had a minimal effect on the composition of human milk with respect to the presence of these bacteria, concentrations of TSLP and TGF- ß isotypes, and the relative expression of miRNAs. Breastfeeding does not result in substantial transfer of these bacteria and none of the investigated breast milk components appeared to significantly contribute to the preventative effect of maternal supplementation on the development of atopic dermatitis. However, probiotic supplementation may lead to a transient increase in TSLP levels in breast milk. More generally, the results of these studies provide insights into the human breast milk components, particularly with respect to the breastfeeding-associated microbiota and human milk miRNA profile.