| dc.description.abstract | Den grunnleggende informasjon om organismene ligger lagret i DNA, som er en polymer sammensatt av fire ulike nitrogenbaser bundet til en sukkerfosfat ryggrad. Langs DNA-tråden ligger ulike gener, og baserekkefølgen innen hvert gen bestemmer genproduktets egenskaper. For at en celle skal kunne lage et protein kodet i den genetiske byggeplanen, må den først transkribere genet til et enkelttrådet RNA-molekyl som så translateres til en polypeptidkjede med bestemte aminosyrer. Hvor mye protein som dannes fra ett gen vil til enhver tid kunne reguleres av basemodifikasjoner både i DNAet selv, eller i det transkriberte RNAet. Metylering av nitrogenbasene utgjør her en viktig regulatorisk endring både i DNA og RNA. Ofte oppstår også uønskede modifikasjoner, eller skader, som kan påvirke genuttrykket. Dette omfatter også uønsket metylering av basene i DNA eller RNA. Hvis slike skader oppstår i DNA, kan de medføre feilkoding under replikasjonen. Det er derfor viktig at DNAet repareres før det replikeres, for å unngå arveligemutasjoner og sykdom som for eksempel kreft. Å forstå hvordan celler reagerer på ulike baseskader og hvordan de kan skille mellom uønskede baseskader og funksjonelle modifikasjoner, er av stort interesse for vitenskapen og medisinen.
I denne avhandlingen har vi undersøkt en reparasjonsmekanisme som fjerner metylgrupper fra 1-posisjon i adenin (m1A) og 3-posisjon i cytosin (m3C) i både DNA og RNA. Disse metyleringene kan ha sitt opphav både i metabolske prosesser og eksponering mot ulike miljøgifter eller legemidler. Ett viktig enzym som kan fjerne disse metyleringene er den α-ketoglutarat/jern-avhengige dioksigenasen ALKBH3.
Vi har studert ALKBH3-katalysert demetylering av DNA og RNA i celler etter behandling med metylmetansulfonat (MMS) – et vanlig alkylerende agens. Dessuten undersøkte vi rollen av aktiverende signal kointegrator kompleks 1 (ASC-1), et proteinkompleks som består av de fire subenhetene ASCC1-3 og TRIP4, og som interagerer funksjonelt med ALKBH3. Vi viser at ASCC2 binder ubiquitinkjeder som er enzymatisk knyttet til proteiner som reaksjon på metyleringsskader i DNA. ASCC2 rekrutterer så ASCC3, en DNA-helikase, som åpner DNA helixen slik at ALKBH3 kan fjerne m1A. Celler med defekt ASCC2 kunne ikke lenger danne reparasjonsfoci av ALKBH3 eller ASCC3 og viste redusertm1A-fjerning fra DNA. Ved å anrike messenger RNA (mRNA) fra MMS-behandlede celler, fant vi at MMS-behandlingen økte binding av ASCC3 til mRNA. Resultatene viste videre at celler med defekt uttrykk av ASCC3 hadde redusert evne til å fjerne MMS-indusert m1A og m3C fra mRNA. I fant også at MMS-behandling medførte selektivt nedsatt binding av 40S ribosomal subenhet til mRNA. Vi har sammenfattet resultatene i en modell hvor ASCC3 medierer translokasjon av ikke-translaterte mRNA til reparasjon eller degradering i ALKBH3-holdige P-bodies, mens translatert mRNA brytes ned via No-Go-Decay (NGD), en nedbrytningsmekanisme som aldri før har blitt påvist i pattedyr. Vi har også sett nærmere på samtlige subenheter i ASC-1 komplekset og deres betydning for regulering av funksjonelle modifikasjoner og metylskader i mRNA. Her finner vi ulike effekter ved defekt i de ulike subenhetene. Prosessering av metyleringsskader i mRNA er mest avhengig av ASCC3 og ALKBH3, mens ASCC1 og TRIP4 ser ut til å ha komplementære funksjoner. I MMS-behandlede celler akkumulerer ASCC1 og ASCC3 rundt P-bodies. Videre vil mangel på enten ASCC3 eller ASCC2 destabilisere hele ASC-1 komplekset. Både ASCC3, TRIP4 og ALKBH3 ser ut til å være involvert i å opprettholde en balansert m1A-nivå i mRNA. ASCC2s rolle i demetylering ser hovedsakelig ut til å være begrenset til DNA-reparasjon. Ved høysensitive LC-MS/MS-analyse fant vi til slutt også signifikante mengder av 5- metyluracil (m5U) og 3-metyluracil (m3U) i mRNA i ubehandlede celler. Disse modifikasjonene har tidligere ikke vært beskrevet i mRNA, og kan utgjøre nye regulatoriske modifikasjoner.
I sum har arbeidet med denne avhandlingen gitt ny kunnskap om ALKBH3-mediert demetylering av m1A og m3C i DNA og mRNA. Mens ASCC2 er viktig for DNA-reparasjon, er ASCC3 viktig for mRNA-reparasjon og balansert innhold av endogene mRNA basemetyleringer. ASCC1 og TRIP4 støtter ASCC3 og ASCC2 i sine funksjoner, og hele komplekset samarbeider med ALKBH3 for å skape og opprettholde en sunn metyleringsbalanse. | nb_NO |
