Elucidating the pathogenesis of osteochondrosis using nonlinear optical microscopy

Abstract

Abstract

Osteochondrosis is defined as a focal disturbance in endochondral ossification and causes joint pain and lameness in several species of animals, including humans. The focal disturbance occurs at predilection sites in various joints and can in some cases lead to detachment of a piece of the articular cartilage. This condition is known as osteochondritis dissecans (OCD). In this thesis, osteochondrosis and OCD are considered to belong to the same disease process, where OCD is defined as the advanced stage. Osteochondrosis has a very high prevalence in pigs and is a common cause of leg weakness and premature slaughter. To reduce the prevalence, a better understanding of how the disease develops is required. Previous studies have demonstrated that osteochondrosis is caused by focal failure of the temporary cartilage canal blood supply to epiphyseal growth cartilage, most likely when the blood vessels become incorporated into the ossification center. The vascular failure causes a local ischemic chondronecrosis in the growth cartilage that resists replacement by bone and leads to a focal disturbance in ossification. However, it remains to be clarified why the blood supply fails. Moreover, the progression from osteochondrosis to OCD has been associated with biomechanical factors, but more research is necessary to understand why some areas of chondronecrosis can heal spontaneously while others progress to OCD. The aim of this thesis was to obtain new information about the pathogenesis of osteochondrosis and how osteochondrosis progresses to OCD in the distal femur of 70-180-day-old pigs using a microscope based on two nonlinear optical phenomena; second harmonic generation (SHG) and two-photon excitation fluorescence (TPEF).With this microscopic technique, unique information about the collagen organization and the cells in the cartilage can be obtained in thick sections without staining. The results showed that the matrix surrounding blood vessels in the cartilage varied, both in terms of the organization of collagen fibrils and in terms of calcification. These variations were hypothesized to be important when the blood vessels become incorporated into the ossification center and therefore relevant in the cause of vascular failure. However, incorporation could not explain all cases of ischemic necrosis, and the caudal cruciate ligament was shown to have a role in some cases. Moreover, the SHG signal was used to reveal matrix fissures and microsplits in the chondronecrotic areas that potentially can propagate and cause pathological fractures and OCD. Progenitor-like cells were identified at the margin of the lesions with a potential repair function. The work in this thesis has therefore resulted in new information that will be important for future work into the cause of ischemic necrosis and for generating models predicting how lesions will progress.

Sammendrag

De fleste vev i kroppen er avhengig av blodtilførsel, og hvis blodtilførselen blir brutt til for eksempel en del av hjertet eller hjernen, kan det oppstå hjerteinfarkt eller hjerneslag. Vekstbrusk er et vev som også kan miste en del av blodtilførselen, og det kan føre til en sykdom som kalles osteokondrose. I denne doktorgraden har jeg sett på hvorfor blodtilførselen noen ganger svikter i vekstbrusken og hva som kan skje som følge av det.

Vekstbrusk befinner seg på enden av voksende knokler hos barn og unge dyr og blir gradvis erstattet av knokkelvev etter hvert som man vokser. Tap av blodtilførsel til et område i vekstbrusken fører imidlertid til at området ikke erstattes av knokkelvev. Denne lokale forstyrrelsen i knokkeldannelse vises på røntgenbilder og er kjennetegnet på osteokondrose. Videre kan dette føre til sprekkdannelser og løse biter inni leddet. Osteokondrose er én av de viktigste årsakene til leddproblemer hos griser, men rammer også mennesker og andre dyr. Det er anslått at nesten alle griser får osteokondrose, med eller uten symptomer, og at mange griser må slaktes for tidlig på grunn av dette. Det har ikke vært kjent hvorfor blodtilførselen stopper opp og osteokondrose oppstår, og å finne årsakene til sykdommen er viktig for å kunne forhindre og behandle den.

I dette prosjektet har jeg brukt en ny teknikk som kalles ikke-lineær optisk mikroskopi til å studere vekstbrusken i kneet til 70-180-dager gamle griser. Denne teknikken er basert på en intens, pulserende laser som fokuseres på et område i prøver bestående av 100 µm-tykke snitt. Det intense lyset kan vekselvirke med et protein som kalles kollagen, og det gjør at nye lysbølger sendes ut med bølgelengde lik halvparten (445 nm) av bølgelengden til laseren (890 nm). Dette kalles andre-harmonisk generasjon og gir informasjon om organiseringen av kollagenet. Laserlyset ble også brukt til å få informasjon om cellene ved hjelp av to-foton-eksitasjon av fluorescerende molekyler.

Med dette avanserte mikroskopet har jeg vist at det er variasjoner i vevet rundt blodkarene. Dette kan være viktig for å forstå hvorfor noen blodkar svikter når de blir innlemmet i knokkelen. Én følge av at blodtilførselen svikter, er at cellene i brusken dør. I noen områder med død brusk ble det påvist mindre kollagen og små sprekker i vevet. Dette kan være starten på større sprekker og brudd. Denne forskningen har dermed bidratt til å øke forståelsen av hvordan osteokondrose oppstår og hvorfor sykdommen forårsaker sprekker og løse biter i leddet.