Typing av Legionella pneumophila med MALDI-TOF MS

Abstract

Legionella pneumophila er fakultativ intracellulære bakterier som lever naturlig i akvatiske habitater. De kan replikere i makrofager og protozoer, bli overført til mennesker gjennom areosoler og føre til smitte. Ved eventuelle utbrudd er det viktig å kunne identifisere kilden, noe som i dag bli gjort ved å typebestemme L. pneumophila med sekvensbasert typing (SBT). Samtidig har matrix-assisted laser desorption/ionization ? time-of-flight (MALDI?TOF) mass spectrometry (MS) vist seg å kunne brukes til rask og effektiv identifisering av en rekke mikroorganismer på artsnivå, deriblant Legionella. Hos enkelte andre mikroorganismer har MALDI?TOF MS også vist å kunne skille mellom underarter. MALDI?TOF MS ble i denne oppgaven benyttet for å undersøke om det var mulig å skille L. pneumophila fra hverandre på stammenivå ved hjelp av MALDI Biotyper 3.0 programvare. Standardprotokollen anbefalt av Bruker Daltonics for proteinekstraksjon fra mikroorganismer ble tilpasset/optimalisert for bruk på L. pneumophila, slik at reproduserbare massespektre ble oppnådd. Evalueringen viste at proteinekstraksjon fra ca 2 µl biologisk materiale med 10 µl acetonnitrill og 10 µl maursyre, ga best scoreverdi opp mot Bruker Daltonics referansebibliotek. Den optimale temperaturen og varigheten for dyrkning ble vist å være henholdsvis 37 ˚C og 48 ± 2 timer. Det ble vist at lagring av skåler/kolonier med L. pneumophila ved 37 ˚C førte til forandringer i massespektrene, mens lagring ved 20 ˚C ikke medførte slike forandringer og at stabile massespektre ble oppnådd etter seks dagers lagring.Det ble bygget opp et referansebibliotek i MALDI Biotyper 3.0 bestående av referansespekter/referansetopplister (MSP) fra til sammen 48 Legionella spp. hvorav 41 var L. pneumophila -isolater. Med referansebiblioteket ble det vist at MSP (dannet ved standard innstillinger) for mange L. pneumophila var for like hverandre til å gi identifisering mot egne MSP. En klyngeanalyse ble brukt i sammenligning av L. pneumophila mellom SBT og MSP fra referansebiblioteket dannet med MALDI?TOF MS. Sammenligningen viste at diversiteten i proteinsammensetningen hos L. pneumophila, representert som MSP, ikke ga samme oppløselighet som gjennom sekvensvariasjonene fra genene i SBT -analysen.