| dc.description.abstract | Den sentrale karbohydratmetabolismen i Pseudomonas fluorescens, med vekt på opptak og metabolisme av glukose, ble forsøkt kartlagt ved litteraturstudier og bioinformatisk analyse av tilgjengelige genomsekvenser. Det ble konkludert med at P. fluorescens tar opp glukose fra omgivelsene via poriner i ytre membran og glukose ABC-transportere i indre membran, og at den sentrale glukosemetabolismen omfatter ED-sporet, det direkte oksidative sporet, pentosefosfatsporet, glukoneogenesen og nedre del av glykolysen. Ved glukosekatabolisme via det direkte oksidative sporet omdannes glukose til glukonat og 2-ketoglukonat i periplasma. Ketoglukonat og 2-ketoglukonat transporteres deretter over indre membran via transportere drevet av kjemiosmotiske gradienter. Genkandidater for alle enzymene og proteinene i de ovennevnte transportsystemene og metabolske sporene ble funnet.
Biosyntese av alginat er koblet til den sentrale karbohydratmetabolismen ved at fruktose-6-fosfat er utgangspunktet for alginatsyntese. I forkant av alginatsyntese i P. fluorescens dannes sannsynligvis fruktose-6-fosfat fra glukose ved nedbryting til trioser via ED-sporet, etterfulgt av resirkulering til fruktose-6-fosfat via glukoneogensen. Konvertering av glukose til 6-fosfoglukonat, et viktig mellomprodukt i ED-sporet, kan gå via to spor; det direkte oksidative sporet og det fosforylative sporet. P. fluorescens har også genet for glukose-6-fosfat isomerase (pgi), som katalyserer isomerisering av glukose-6-fosfat til fruktose-6-fosfat. Det ble framsatt en hypotese om at å blokkere glukosemetabolisme via det direkte oksidative sporet eller det fosforylative sporet kunne kanalisere mer glukose mot direkte konvertering til fruktose-6-fosfat, fremfor nedbryting og resirkulering via ED-sporet og glukoneogenesen. Dette kunne tenkes å bedre utnyttelsen av glukose med hensyn på alginatsyntese.
I den eksperimentelle delen av arbeidet ble P. fluorescens NCIMB 10525 og Pf201 benyttet. NCIMB 10525 produserer ikke alginat, mens Pf201 er en alginatproduserende NCIMB 10525-mutant. Med utgangspunkt i disse stammene ble det konstruert mutanter med en delesjon i genet for glukose dehydrogenase (gcd) eller glukose-6-fosfat dehydrogenase (zwf-1 eller zwf-2). Disse enzymene katalyserer tidlige trinn i henholdsvis det direkte oksidative sporet og det fosforylative sporet. Mutantenes evne til å vokse med glukose som karbonkilde, samt aktiviteten av glukose dehydrogenase og glukose-6-fosfat dehydrogenase, ble undersøkt. For mutantene avledet fra Pf201 ble også alginatproduksjon undersøkt. I tillegg ble pgi sekvensert og klonet inn i en vektor, da overuttrykk av dette genet også kunne tenkes å kanalisere mer glukose mot direkte konvertering til fruktose-6-fosfat. Overuttrykk ble imidlertid ikke gjennomført.
De innførte mutasjonene så ikke ut til å forbedre alginatsyntese fra glukose. I Pf201Δgcd og Pf201Δzwf-2 lå alginatproduksjonen på samme nivå som i Pf201, mens Pf201Δzwf-1 ikke produserte alginat. Zwf-1 ser altså ut til å være nødvendig for alginatsyntese, men det er uvisst hvorfor. Alle de konstruerte mutantene var i stand til å vokse med glukose som eneste karbonkilde. Inaktivering av zwf-1 førte til kortere generasjonstid, mens inaktivering av zwf-2 ikke påvirket veksten. Dobbeltmutanten NCIMB 10525Δzwf-1Δzwf-2 hadde imidlertid både lengre lag-fase og lengre generasjonstid enn utgangsstammen. Inaktivering av gcd førte til lengre lagfase og lengre generasjonstid i Pf201-mutanten, men påvirket ikke vekst i mutanten avledet fra NCIMB 10525. Det er imidlertid usikkert om inaktivering av gcd lyktes i NCIMB 10525Δgcd. I både NCIMB 10525 og Pf201 ble det detektert høyest aktivitet av glukose dehydrogenase etter dyrking ved lave glukosekonsentrasjoner. I NCIMB 10525 og NCIMB 10525Δzwf-2 var aktivitet av glukose-6-fosfat dehydrogenase høyest etter dyrking ved lave glukosekonsentrasjoner, mens aktiviteten var lik ved begge konsentrasjonene i NCIMB 10525Δzwf-1. Pf201, Pf201Δzwf-1 og Pf201Δzwf-2 viste høyest aktivitet av glukose-6-fosfat dehydrogenase etter dyrking ved høye glukosekonsentrasjoner. Forskjellene i enzymaktivitet og påvirkning av vekst tyder på at det kan være forskjeller i glukosemetabolismen til NCIMB 10525 og Pf201. | nb_NO |
