Epigenetiske forandringer i in vitro transformerte humane bronkieepitelcellelinjer: Vekstpotensiale og DNA-metylering i FOXA-gener

Abstract

Lungekreft har vært den mest utbredte formen for kreft i verden i flere tiår og det er behov for økt kunnskap om cellulære mekanismer som ligger til grunn for sykdommen. Tradisjonelt har kreft blitt sett på som en genetisk sykdom, men nyere forskning har vist at humane kreftceller har globale epigenetiske avvik i tilegg til genetiske og at disse epigenetiske forandringene er viktige for kreftutviklingsprosesssen. Humane bronkieepitel cellelinjer (HBEC) transformerte in vitro ved eksponering for karsinogener fra tobakksrøyk i 12 uker ble brukt som modell for å studere mekanismer involvert i tidlig stadier av lungekreftutvikling, med vekt på epigenetiske forandringer. Det ble benyttet transformerte celler fra to HBEC-celleinjer; HBEC-2KT og HBEC-12KT. Det ble gjort veksthastighetsforsøk med Cell Titer Blue-assay på utvalgte transformerte cellelinjer. For 12KT cellelinjene ble det detektert statistisk signifikant høyere veksthastighet for de transformerte cellelinjene enn for kontrollcellene, hvorimot 2KT viste signifikant lavere veksthastighet enn kontrollene. Normalt vev kontrollerer nøye produksjon og utslipp av vekstsignaler, mens kreftceller utvikler evnen til å deregulere disse signalene og tar kontroll over sin egen prolifereringsevne. Resultatene fra veksthastighetsforsøkene tyder på at de transformerte cellelinjene har utviklet evnen til å vokse mer eller mindre uavhengig av eksterne vekstsignaler. Et annet viktig steg i kreftutviklingen er aktivering av epitelial-til-mesenkymal transisjon (EMT) programmet. Resultater vedrørende EMT fra en parallell masteroppgave, samt genuttrykksanalyser av cadheriner, viste at cellene har et aktivert EMT-program. Dette kan stå i sammenheng med endret veksthastighet. Mange Forkhead box (FOX)-gener har blitt antatt å være protoonkogener eller tumor-suppressorgener med mulig forandret metylering i kreftceller. FOXA2-genet er essensielt for epiteldifferensieringen i luftveiene og har tidligere blitt assosiert med nedregulering i lungekreftceller. Dette kan derfor være en sannsynlig kandidat i patogenesen i lungekreft. Lite er kjent om FOXA1 i lunge/lungekreft, men genet har blitt foreslått å være en viktig pionerfaktor som regulerer gener i brystkreftutvikling. Inhibering av FOXA1/2 transkripsjonsfaktorer har også blitt assosiert med EMT. Tidligere genuttrykksanalyser av de transformerte HBEC-cellelinjene viste signifikant nedregulering av FOXA1 og FOXA2 i alle transformanter. En mye studert epigenetisk modifikasjon er DNA-metylering. En stor del av alle humane CpG-øyer blir utsatt for økende metylering i kreftceller som kan lede til avvikende genuttrykk. I denne oppgaven ble metyl-DNA-immunopresipiterings(MeDIP)-metoden for bestemmelse av metyleringsnivå etablert. Denne ble brukt videre til å bestemme metylering i CpG-områder for FOXA1 og FOXA2 i utvalgte transformerte cellelinjer og lungevevspar. Dette ble sammenlignet med genuttrykksanalyser ut ifra en hypotese om at metylering i promotorområder kan være med på å forklare forandret genutrykk. Det ble funnet et CpG-område i FOXA1 og to CpG-områder i FOXA2 som hadde høyere metyleringsgrad enn de andre undersøkte CpG-områder. Dette kan tyde på hypermetylering i disse CpG-øyene i de undersøkte cellelinjer. Det ble ikke funnet tydelige forskjeller i metylering mellom transformerte og ikke-transformerte celler, og dette kunne derfor ikke settes i sammenheng med nedregulering av FOXA1 og FOXA2. Det ble funnet økt metyleringsgrad i tumorprøve i forhold til normal prøve for et av tre lungevevspar. De to andre hadde liten forskjell i metylering mellom tumor og normal prøve. Det er derfor vanskelig å sette metylering i sammenheng med genuttrykk. For alle prøver (både fra cellelinjer og fra humane lungevev) var nivåene av metylering detektert med MeDIP-metoden lave. Dette kan være en grunn til at det ikke ble funnet tydelige sammenhenger mellom metyleringsnivå og genekspresjon. Det kan konkluderes med at MeDIP-metoden kan være en metode for storskala metyleringsanalyser, men mye tyder på at den er avhengig av et høyt metylcytosinnivå for spesifikk detektering.