Genetiske verktøy i Bacillus methanolicus

Abstract

Produksjon av aminosyrer ved hjelp av industriell bioteknologi er et voksende marked. I dag finnes det ingen kjente metylotrofe bakterier som benyttes til industriell produksjon av aminosyrer, men en attraktiv kandidat for framtidig produksjon er den termofile og metylotrofe bakterien Bacillus methanolicus. For å kunne utvikle en konkurransedyktig produksjonsstamme av B. methanolicus er det nødvendig med genetiske verktøy. Et viktig verktøy er et reportergen som blant annet kan utnyttes for å analysere promotere. Et av hovedformålene med denne oppgaven var å teste reportergenet lacZ som stammer fra den termotolerante bakterien B. coagulans, og deretter utvikle et assay for bestemmelse av aktiviteten til genproduktet β-galaktosidase. Dette reportergenet ble også brukt til å analysere styrken til ulike promotere i B. methanolicus MGA3. Promotorene som ble undersøkt (som også stammet fra B. methanolicus) var promotere til viktige gen i metanolassimileringen (mdhp og pfkp) og den potensielle promoterregionen til et metanoldehydrogenase-gen (mdh2p). I tillegg ble det testet en kobberinduserbar promotor (Cup) fra Lactobacillus sakei. I denne oppgaven ble også det antatte replikasjonsproteinet til den potensielle vektoren pBM69 undersøkt. pBM69 ble oppdaget i B. methanolicus MGA3 etter at genomet ble sekvensert. Det ble konstruert vektorer hvor de aktuelle Promotorene var lokalisert oppstrøms for reportergenet lacZ, deretter ble B. methanolicus transformert med vektorene. Den første bekreftelsen på at reportergenet var aktivt i B. methanolicus kom under transformasjon, hvor B. methanolicus transformert med vektorene pTH1mdhp-lacZ og pTH1Cup-lacZ ga opphav til blå kolonier da kulturene ble platet ut på fast medium tilsatt X-gal. B. methanolicus transformert med pTH1mdh2p-lacZ og pTH1pfkp-lacZ ga ikke blå kolonier. Utvikling av assayet ble utført med celleekstrakt fra B. methanolicus MGA3 transformert med pTH1mdhp-lacZ. Aktiviteten ble undersøkt ved ulike betingelser for å optimere assayet. Det ble testet ulike pH-verdier for bufferen og det ble undersøkt hvordan preinkubering av enzymet påvirket aktiviteten. Den optimale pH-verdien for assayet viste seg å være rundt 7 og det ble funnet en signifikant økning i enzymaktiviteten når enzymet ble preinkubert i fem minutter ved temperaturene 45, 50 og 60 °C. Enzymaktiviteten holdt seg også stabil etter preinkubering med de gitte temperaturene i inntil 30 minutter. Etter etablering av assay ble det ved alle målingene benyttet buffer med pH 7,0 og enzymet ble preinkubert i 5 minutter ved 50 °C. Den kobberinduserbare promotoren var aktiv i B. methanolicus MGA3. For å undersøke hvordan ulike konsentrasjoner av induseren CuSO4 påvirket veksten til B. methanolicus pTH1Cup-lacZ, ble det utført forsøk hvor kulturene ble indusert med konsentrasjoner fra 0 µM til 200 µM av CuSO4. Det var tydelig at veksten ble påvirket med økende konsentrasjon av CuSO4 og ved 200 µM døde cellene. De resterende kulturene ble høstet etter hvert som OD600 = ca 1,5 og enzymaktiviteten til β-galaktosidase i hvert celleekstrakt ble bestemt. Aktiviteten for hver kultur økte med økt konsentrasjon av induser, men det var vanskelig å sammenligne aktivitetene ettersom kulturene ble høstet etter ulik inkuberingstid. I celleekstrakt fra B. methanolicus transformert med vektorene pTH1pfkp-lacZ og pTH1mdh2p-lacZ var det ikke mulig å detektere aktiviteten til β-galaktosidase. Reportergenet lacZ som ble undersøkt i denne oppgaven er det første reportergenet som har gitt gode resultater i B. methanolicus. Det etablerte assayet kan blant annet benyttes til å undersøke nye promotere i B. methanolicus og dermed øke kunnskapen om regulering av transkripsjon. Av Promotorene som ble undersøkt var mdhp den sterkeste, noe som var forventet på bakgrunn av tidligere eksperimenter. Kobberpromotoren var aktiv, men ga opphav til enzymaktivitet selv om den ikke var indusert. Det må dermed utføres flere forsøk med denne promotoren for å avgjøre hvor godt den er egnet til kontrollert ekspresjon i B. methanolicus. Replikasjonsproteinet til pBM69 ble undersøkt, men på grunn av ustabilt DNA som førte til at deler av den amplifiserte sekvensen ble slettet etter transformasjon, var det ikke mulig å bekrefte om pBM69 faktisk er et plasmid.