A Hybrid Flow Cytometric Approach to the Mussel Micronucleus Cytome Assay

Abstract

Til tross for den utbredte bruken av musling mikronukleus cytom-assayet innen akvatisk økotoksikologi(Bolognesi and Fenech, 2012), så har denne protokollen flere begrensninger og utfordringer ved seg; hvorav de fleste kan bli håndtert ved flow cytometri. Manuel scoring av cytogenisk skade i definerte subpopulasjoner av musling-hemocytter er en tidkrevende og arbeidsintensiv prosess med lav kapasitet. Den utvidede omfanget av å vurdere subtile cytotoksiske endringer og celletyper fra et veldig begrenset referanse-materiale forverrer dette ytterligere, og gir rom for subjektivitet når operatøren står overfor den overveldende kompleksiteten i hemocytt morfologi. Ettersom visse celletyper er rapportert å være mindre følsomme for mikronukleus (MN)-induksjon (\cite{Venier1997}), og andre kan vise morfologiske trekk som er forvekslingsvis lik cytotoksiske endringer, kan slike forviklinger muligens redusere følsomheten og mellom-laboratoriums sammenlignbarheten av musling mikronukleus cytom assayrt. På bakgrunn av dette, var det overordnede målet med denne studien å utvikle en enkel og pålitelig hybrid flow-cytometrisk versjon av musling mikronukleus cytom assayet med hemocytter fra blåskjell (\emph{Mytilus edulis}). Denne tilnærmingen vil beholde konvensjonell scoring av genotoksiske biomarkører og apoptose ved lysmikroskopi, men var rettet mot å forenkle scoringen av nekrotiske hemocytter og å utføre den differensielle hemocytt tellingen med en ny flow-cytometrisk metode. Her viser vi at de tre morfologisk distinkte celletypene i \emph{M. edulis} kan skilles på grunnlag av lys-spredningsmålinger på grunn av deres iboende forskjeller i granulæritet og/eller størrelse. Ved å utnytte ulikhetene deres i tetthet, fargestoff-affiniteter og Calcein AM-effluksrater, var vi i stand til å karakterisere og identifisere hver celletype ved tetthets-avhengif sentrifugering, en optimalisert Eosin Y farge-prosedyre og farging med den celle-permeable fluoriserende proben Calcein AM. Fra våre resultater foreslår vi en rask og pålitelig flow-cytometrisk differensiell hemocytt telling ved bruk av log Calcein (533/15 nm) og log SSC som primære diskriminatorer. Siden den foreslåtte metoden bruker Calcein AM - kan denne prosedyren kombineres med TO-PRO-3 Iodide for paralell scoring av nekrotiske hemocytter ved hjelp av en Calcein AM/TO-PRO$^{TM}$-3 Iodide vitalitetsanalys som ble utviklet og validert for denne protokollen. Disse prosedyrene blir foreslått som en raskere og mer pålitelig tilnærming til scoring av nekrotiske hemocytter og celletyper i musling mikronukleus cytom assayet med \emph{M. edulis}. Ved å la flow-cytometeret ta noe av byrden av operatøren, har den foreslåtte metoden potensial til å forbedre statistisk power og effektivitet til eksisterende analysen.

In spite a widespread adoption of the Mussel micronucleus cytome assay in aquatic ecotoxicology (Bolognesi og Fenech, 2012), this protocol has several limitations or drawbacks; most of which has the potential to be addressed by flow cytometry. The manual scoring of cytogenic damage in defined subpopulations of bivalve haemocytes is a time-consuming and labor-intensive process with low throughput. The expanded scope of scoring subtle cytotoxic alterations and cell-types with a minimal reference material further aggravates this fact, and leaves too much room for subjectivity when the operator is faced with the complexity of haemocyte morphologies. Since certain cell types have been reported less sensitive to micronucleus (MN) induction (Venier, 1997), and others may exhibit morphological features deceptively similar cytotoxic alterations, confusions of this sort can possibly reduce the sensitivity and inter-lab comparability of the micronucleus cytome assay. For this reason, the overall aim of the present study was to develop a simple and reliable hybrid flow cytometric version of the Micronucleus cytome assay with haemocytes from the common blue mussel (\emph{Mytilus edulis}). This approach would conserve the conventional scoring of genotoxic biomarkers and apoptosis by light microscopy, but was aimed to streamline the scoring of necrotic haemocytes and perform the differential haemocyte count with a novel flow cytometric methodology. Here we show that the three morphologically distinct cell types of \emph{M. edulis} are distinguishable according to light-scatter measurements because of their inherent differences in granularity and/or size. By utilizing their dissimilarities in density, staining affinities and Calcein AM efflux rates, we were able to characterize and identify each cell type by isopycnic separation, an optimized Eosin Y staining procedure and staining with the cell permeable fluorescent probe with Calcein AM. From these insights, we propose a rapid and reliable flow cytometric differential haemocyte count employing log Calcein (533/15 nm) and log SSC as primary discriminators. As the proposed methodology employs Calcein AM -- this procedure can be combined with TO-PRO-3 Iodide for simultaneous scoring of necrotic haemocytes by a Calcein AM/TO-PRO$^{TM}$-3 Iodide viability assay that was developed and validated for this protocol. These procedures are proposed as faster and more reliable approach to scoring necrotic haemocytes and cell types in the Mussel micronucleus cytome assay with \emph{M. edulis}. By letting the flow cytometer take some of the load off the operators shoulders, the proposed methodology has potential to improve the power and efficiency of the existing assay.