Periodate oxidation of alginate-b-dextran diblocks for ligand attachment

Abstract

Diblokker, som alginat-b-dekstran, kan sammen med radionuklider danne nanopartikler i stand til å strålebehandle kreft. Tradisjonell strålebehandling skader friskt vev på vei gjennom kroppen, mens nanopartiklene kan sendes direkte til kreftcellene via blodstrømmen for å unngå dette. For å lokalisere kreftcellene må ligander festes til nanopartiklene. Ligandene festes til aldehyder i dekstrandelen av diblokkene ved hjelp av klikk-kjemi, og periodatoksidasjon brukes for å danne disse aldehydene. I denne masteroppgaven var målet å få innsikt i periodatoksidasjonen av alginat-b-dekstran-diblokker, og å lokalisere og kvantifisere dialdehyder ved hjelp av oksyaminer. Metodene brukt for å oppnå dette var blant annet dialyse og 1H NMR-spektroskopi.

Oksyaminet OBHA ble brukt til å detektere dialdehyder fordi det inneholder en aromatisk ring som synes godt ved 1H NMR. Ved hjelp av 1H NMR ble det bekreftet at OBHA fungerte til å detektere dialdehyder, men kun i kortere oksiderte kjeder. Resultatene ble derimot utydelige med oksidert Dex6000. Et eksperiment med oksidert Dex6000 og tre andre oksyaminer indikerte at dette var på grunn av den høye molekylvekten til Dex6000. Videre viste det seg også å være utfordrende å kvantifisere dialdehyder og å bestemme den eksakte posisjonen deres i kjeden, uavhengig av molekylærvekt.

Det viste seg at periodatoksidasjonen, reaksjonen med OBHA og den gjennomgående karakteriseringen kunne utføres i ett og samme NMR-rør. Dette forenklet prosedyren brukt gjennom hele arbeidet.

Det ble vist at periodatoksidasjonen av dekstran og alginat er omtrent like rask. Derfor må dekstrandelen av diblokkene oksideres før den blir satt sammen med alginatdelen, oksidasjonen kan nemlig påvirke hvordan sistnevnte binder ioner.

Det viktigste funnet i masteroppgaven var at periodatoksidasjon førte til at bindingen mellom dekstran og begge koblingsmolekylene PDHA og ADH ble brutt. Hvis allerede periodatoksidert dekstran skal kobles til et av koblingsmolekylene, kan koblingen skje på hvilket som helst aldehyd, ikke bare den reduserende enden. Dette er uønsket fordi laterale substitusjoner kan endre en polymers egenskaper i forhold til den originale kjeden. Resultatet indikerer at den reduserende enden til dekstran er mer utsatt for periodatoksidasjon enn resten av kjeden. Funnet er viktig fordi PDHA og ADH har blitt brukt som koblingsmolekyler i alt tidligere arbeid på diblokker.

Parallelt oppdaget medstudent Julie S. Elvsaas at PDHA løsnet fra SBG også. Dette indikerer at en annen kjemisk reaksjon enn periodatoksidasjon har skjedd, ettersom bindingen mellom SBG og PDHA ikke er oksiderbar. Som forventet løsnet ikke ADH fra SBG.

I fremtidig arbeid burde det undersøkes hvorfor periodatoksidasjon fører til at PDHA løsner fra både dekstran og SBG, når bindingen mellom SBG og dekstran ikke er oksiderbar. Det burde også undersøkes om det stemmer at den reduserende enden til dekstran er mer utsatt for periodatoksidasjon enn resten av kjeden. For å fortsette arbeidet med alginat-b-dekstran kan den reduserende enden til dekstran blokkeres (for eksempel ved metylering) før periodatoksidasjon og kobling av ligandene, for å unngå at PDHA løsner. Et mer tidsbesparende alternativ ville vært å avslutte arbeidet med alginat-b-dekstran og fortsette videre med alginat-ADH-SBG.

Det andre målet med masteroppgaven var å lage alginat-b-alginat-diblokker for å gjennom et ionebytteeksperiment bestemme om "hårnåler" binder ioner sterkere enn to frie kjeder. Det viste seg å ikke være tilstrekkelig å dialysere prøvene seks ganger mot MQ-vann, da nullprøvene fortsatt inneholdt ioner. I fremtidige eksperimenter må dialysen gjentas flere ganger.

In combination with radionuclides, a diblock such as alginate-b-dextran can form a nanoparticle (NP) able to perform targeted radiation therapy on cancer cells. Targeted radiation therapy causes less damage on healthy tissue than today´s cancer treatments. The NP requires carefully selected ligands to detect the cancer cells. These are attached to the NP via oxyamine click chemistry, at reactive dialdehydes introduced by periodate oxidation. The aim of this research was to investigate the periodate oxidation of alginate-b-dextran diblocks and to detect and quantify the resulting dialdehydes using oxyamines. The method applied to achieve this was 1H NMR spectroscopy.

1H NMR revealed that the detection of dialdehydes in oxidized oligomers using the oxyamine OBHA was successful. OBHA was used as it contains an aromatic ring easily observed by 1H NMR. However, the detection proved to be challenging in oxidized Dex6000, presumably due to its high molecular weight. Additionally, it was too challenging to quantify the dialdehydes and establish their exact position using 1H NMR, regardless of the sample´s molecular weight.

Another discovery was that the periodate oxidation and the subsequent conjugation reaction can be carried out in one NMR tube, significantly simplifying the procedure employed throughout the work.

It was confirmed by time course 1H NMR that Dexm must be oxidized before attachment of Gn, as their reaction kinetics are similar, and oxidation might disturb the ion-binding properties of the latter.

The most significant finding was that the linker molecules PDHA and ADH were detached from Dexm during periodate oxidation. This suggested that the reducing end of Dexm is more likely to be oxidized than the remaining residues, when attached to a linker molecule. If Dexm is oxidized before conjugation with the linker molecule, the linker molecule might not react with the reducing end, but with the dialdehydes induced by periodate oxidation. This is unwanted as lateral substitutions can perturb the properties of polysaccharides in respect to the original chain. In parallel, fellow master´s student Julie S. Elvsaas performed similar experiments on alginate-b-SBG diblocks and found that PDHA and not ADH was detached from SBG10 during periodate oxidation. As the main chain of SBG lacks vicinal diols, the fact that PDHA was detached suggests that a chemical reaction other than periodate oxidation occurred near the linkage. These findings are significant as PDHA and ADH have been used as linker molecules in all previous research on diblocks.

Further research is required to explain the chemistry behind the detachment of PDHA from both Dexm and SBGm during periodate oxidation. Further research might also explore whether the reducing end of Dexm is more likely to be oxidized than the rest of the chain, when attached to a linker molecule. In order to continue the work on alginate-b-dextran diblocks, the detachment of the linker molecule must be prevented. A solution could be to block the reducing end of Dexm (e.g., by methylation) prior to periodate oxidation and ligand attachment. However, the most time saving option would be to terminate the work on alginate-b-dextran diblocks and proceed with Gn-ADH-SBGm.

The second aim of this research was to prepare symmetrical alginate diblocks in order to determine whether hairpins bind cations stronger than two free chains, through an ion-exchange experiment. The results revealed that dialyzing the samples six times against MQ water was insufficient, and that the dialysis must be even more thorough in future experiments.