Marine sponges from the Trondheim fjord: Exploration of biomass and sulfated polysaccharides

Abstract

Svamper er fastsittende dyr som antas å være den siste felles stamfar til alle levende dyr og blant de aller første flercellede dyrene til å oppstå. Svamper inneholder unike proteoglykaner som er nødvendige for celleaggregering, disse har fått det passende navnet aggregasjonsfaktorer. Festet til et sentralt protein er polysakkarider med høy molekylvekt (~200 kDa) og sulfaterte monosakkarider. Sulfatesterne medierer aggregasjon med andre nærliggende aggregasjonsfaktorer gjennom interaksjoner med kalsiumioner. Aggregasjonsfaktorer er artsspesifikke, både i kjemisk sammensetning og tredimensjonal struktur. Ettersom sulfaterte polysakkarider som heparin og fukoidan har vist nyttige bioaktiviteter har det også oppstått interesse for sulfaterte polysakkarider fra svamper. Et eksempel på bioaktivitet funnet hos sulfaterte polysakkarider fra svamper er aggregasjonsfaktorpolysakkarider fra svampen Microciona prolifera, som inhiberte replikasjon av humant immunsvikt-virus (HIV).

Målene for dette prosjektet var todelte, første mål var utforskning av svampers biomasse. Arbeidet var sentrert rundt fire marine svamper fra Trondheimsfjorden, Antho dichotoma, Geodia barretti, Mycale lingua, og Phakellia ventilabrum. Disse ble samlet av samarbeidspartnere fra SINTEF industri, avdeling for bioteknologi og nanomedisin i forbindelse med prosjektet MARBLES. Utforskede biomasseparametere inkluderer vann og askeinnhold, grunnstoffinnhold, nøytrale monosakkarid-profiler, og totale aminosyre-profiler. Hver analyse avdekte variasjoner av biomassesammensetning på tvers av artene. Noen likheter ble observert, eksempelvis et mye høyere glysin/arginin, glutaminsyre, og asparaginsyre-innhold enn hva som vanligvis observeres i andre proteiner. Dette kommer trolig av et høyt «spongin» innhold i svamper. Spongin er en type kollagen og er i likhet med annet kollagen rikt på glysin. Høyt glutaminsyre og asparaginsyre-innhold kan forklares av et høyt aggregasjonsfaktorinnhold, ettersom aggregasjonsfaktorer fra svampen Microciona parthena har vist seg å ha uvanlig høyt innhold av disse aminosyrene.

Det andre målet for prosjektet var å utvikle en protokoll for ekstraksjon av sulfaterte polysakkarider fra svampers aggregasjonsfaktorer, og avklare deres struktur ved å bruke NMR-spektroskopi. Tre sentrale metoder ble benyttet for å ekstrahere polysakkarider. Strukturen til et polysakkarid ekstrahert ved å benytte kalsiumklorid som utfellingsmiddel ble avklart ved å bruke todimensjonale NMR-eksperiment. Ekstrakter fra Antho dichotoma, Geodia barretti, Mycale lingua, og Phakellia ventilabrum inneholdte α-1,4-glukaner, trolig energilagringspolysakkarider og ikke aggregasjonsfaktorpolysakkarider. Ingen av metodene ga prøver som kunne benyttes til å strukturavklare aggregasjonsfaktorpolysakkarider. Videre analyser med karbohydrat-polyakrylamid-gelelektroforese avslørte at alle prøvene med α-1,4-glukaner, med unntak av en, hadde ioniske egenskaper. En mulig forklaring kan være innhold av uronsyrer eller sulfatestere som har blitt funnet i glykogen fra svampen Aplysina fulva. Et ekstrakt basert på å bruke cetylpyridiniumklorid som utfellingsmiddel, hadde en mørkere farge enn andre prøver etter elektroforese. Dette indikerte et høyere innhold av ioniske stoffer. Det er mulig noen av ekstraktene inneholdte sulfaterte polysakkarider, men at videre rensing er nødvendig for å oppnå et ekstrakt som kan analyseres med NMR-spektroskopi.

I tillegg til arbeidet i forbindelse med marine svamper ble NMR-spektroskopi utført på fukoidan oligomerer fra brunalgen Macrocystis pyrifera. To fraksjoner med enzymatisk nedbrutt fukoidan separert med størrelseseksklusjonskromatografi ble analysert. Den første fraksjonen inneholdte 2,4-sulfaterte-L-fukose monomerer. Den andre fraksjonen inneholdte 2,4- og 3-sulfaterte-L-fukose enheter. Noen av disse var 1→3 bundet.

Sponges are sedentary animals believed to be the last common ancestor of all living animals and among the first multicellular animals to emerge. Sponges contain unique proteoglycans which are essential for cell aggregation, these proteoglycans are aptly named aggregation factors. Connected to a central protein are high molecular weight polysaccharides (~200 kDa) with sulfated residues. The sulfate esters mediate aggregation with adjacent aggregation factors through interactions with calcium ions. Aggregation factors are species specific, both in chemical composition and three-dimensional structure. As sulfated polysaccharides like heparin and fucoidans display useful bioactivities, sulfated polysaccharides from sponges have gathered interest. One example of bioactivity displayed by sulfated polysaccharides from sponges is aggregation factor polysaccharides from the sponge Microciona prolifera, which was found to inhibit replication of human immunodeficiency virus (HIV).

The objectives for this thesis were twofold, firstly was the exploration of sponge biomass. Work was centered around four species of marine sponges from the Trondheim fjord, those being Antho dichotoma, Geodia barretti, Mycale lingua, and Phakellia ventilabrum. These were sampled by cooperators from SINTEF Industry Dept of Biotechnology and Nanomedicine under the MARBLES project. Explored biomass parameters included water and ash contents, elemental content, neutral monosaccharide profiles, and total amino acid profiles. Each analysis revealed variations in biomass composition across the species. Some similarities were observed, such as a much higher glycine/arginine, glutamic acid, and aspartic acid content than what is normally observed in other proteins. This is likely due to a large proportion of sponge biomass being composed of a type of collagen called spongin, which is rich in glycine. High glutamic acid and aspartic acid levels might be explained by a large amount of aggregation factors, as aggregation factors from the sponge Microciona parthena have been reported to contain unusually high amounts of these amino acids.

The second objective for this thesis was to develop a protocol for extraction of sulfated polysaccharides from sponge aggregation factors and to elucidate their structures using NMR spectroscopy. Three main methods were used to extract polysaccharides. The structure of a polysaccharide obtained by utilizing calcium chloride as precipitant was elucidated using two-dimensional NMR experiments. Extracts from Antho dichotoma, Geodia barretti, Mycale lingua, and Phakellia ventilabrum all contained α-1,4-glucans, likely energy-storage polysaccharides and not aggregation factor polysaccharides. None of the methods yielded samples which could be used to elucidate the structure of aggregation factor polysaccharides. Further analysis of the polysaccharide extracts using carbohydrate polyacrylamide gel electrophoresis revealed that all α-1,4-glucan containing samples apart from one, had an ionic component to it. One explanation could be presence of uronic acids or sulfate esters, which has been found in glycogen from the species Aplysina fulva. An extract made based using cetylpyridinium chloride as precipitant had a darker color than other samples after the electrophoresis, indicating a higher content of ionic components. While it is possible some of the extracts contained sulfated polysaccharides, further purification would be required to obtain a sample suitable for NMR spectroscopy.

In addition to the work on marine sponges, NMR spectroscopy was performed on fucoidan oligomers from the brown algae Macrocystis pyrifera. Two fractions of enzymatically degraded fucoidan obtained by size-exclusion chromatography were analyzed. The first fraction contained 2,4-disulfated-L-fucose monomers. The second fraction contained 2,4- and 3-sulfated-L-fucose units, some of which were 1→3 linked.