Analyse av ftalat-påvirkning på genuttrykket i mitokondrie- og cytoskjellettgener ved bruk av qPCR: Sammenheng med kvinnelig fertilitet

Abstract

Infertilitet er et helseproblem på verdensbasis. Mennesker utsettes daglig for hormonforstyrrende kjemikalier, slik som ftalater. Hensikten med oppgaven er å undersøke hvordan ftalatmetabolitten mono(2-etyl-5- hydroksyheksyl)ftalat (MEHHP), påvirker åtte gener utvalgt fra storskala RNA-sekvensering. I RNA-sekvenseringen så genene ut til å endre uttrykksnivå etter eksponering for MEHHP i 1x og 100x konsentrasjonen funnet i studien Midlife Women’s Health Study (MWHS). De utvalgte genene er mitokondriegener: NDUFB10, NDUFB7, NDUFA1 og COX5a, og gener relatert til celleadhesjon og cytoskjelettet: CTNNA1, WASF1, VCL og ACTB. EIF2S1, GADD54GIP1 og RPS3A ble utvalgt som endogene kontrollgener, men RPS3A ble ikke benyttet, da den ikke ble amplifisert ved qPCR. Det ble syntetisert cDNA direkte fra RNA-ekstraherte placentaceller for å kunne kontrollere primere og at det naturlige uttrykksnivået av genene i telomerase-tranformerte humane endometriale stromaceller (THESC) var tilstrekkelig. Det ble utført qPCR-analyse for de elleve genene med cDNA fra cellelinjen THESC som var eksponert for MEHHP i ulike konsentrasjoner, dimetylsulfoksid (DMSO), progesteron og østrogen. qPCR ble gjennomført på instrumentet StepOnePlus Real-Time PCR system. Rådata fra qPCR-analysen ble bearbeidet i LinRegPCR og med komparative Ct-metode. Statistiske tester og fremstilling av figurer ble gjort i GraphPad Prism. Resultatene fra ANOVA-test, Kruskal Wallis-test og post hoc-tester viser ingen signifikante endringer for samtlige av eksponeringsforsøkene for alle genene. T-test og Mann-Whitney U-test viste signifikant forskjell mellom DMSO og MEHHP 10x konsentrasjonen for NDUFB7, 0,1x og 1x konsentrasjonen for WASF1 og 100x konsentrasjonen for VCL. qPCR-resultatene for WASF1 stemte godt overens med resultatene fra RNA-sekvenseringen, i motsetning til resultatene for NDUFB7. VCL-resultatet er signifikant, men motsatt av RNA-sekvenseringsresultatene. De samlede resultatene fra denne oppgaven tyder på at ftalater muligens påvirker stromaceller fra endometriet og dermed kvinnelig fertilitet. For å få total forståelse av ftalaters effekt på infertilitet, er det avgjørende å studere både gennivå, proteinnivå og gjøre funksjonsanalyser.

Infertility is a global health issue. Humans are exposed to endocrine-disrupting chemicals, such as phthalates, daily. The purpose of this study is to investigate the impact of the phthalate metabolite mono(2-ethyl-5-hydroxyhexyl) phthalate (MEHHP) on eight genes selected from RNA sequencing results. These genes showed changes in expression levels after exposure to MEHHP of 1x and 100x the concentration found in the Midlife Women’s Health Study (MWHS). The selected genes are mitochondrial genes: NDUFB10, NDUFB7, NDUFA1 and COX5a, as well as genes related to cell adhesion and cytoskeleton: CTNNA1, WASF1, VCL, and ACTB. EIF2S1, GADD54GIP1 and RPS3A were chosen as endogenous control genes. However, RPS3A was not used, as it was not amplified in the qPCR. cDNA was synthesized directly from RNA-extracted placental cells to verify the primers and ensure that the natural expression levels of the genes in telomerase-transformed human endometrial stromal cells (THESC) were sufficient. qPCR analysis was performed for the eleven genes with cDNA from the THESC cell line exposed to MEHHP at various concentrations, dimethyl sulfoxide (DMSO), progesterone, and estrogen. qPCR was conducted using the StepOnePlus Real-Time PCR system. Raw data from the qPCR analysis were processed using LinRegPCR and the comparative Ct method. Statistical tests and figure generation were performed using GraphPad Prism. The results from the ANOVA test, Kruskal-Wallis test, and post hoc tests showed no significant changes for all exposure experiments across all genes. T-test and Mann-Whitney U-test revealed a significant difference between DMSO and MEHHP at a 10x concentration for NDUFB7, at 0.1x and 1x concentrations for WASF1, and at a 100x concentration for VCL. The qPCR results for WASF1 were consistent with the results from RNA sequencing, unlike the results for NDUFB7. The VCL result is significant but in the opposite direction compared to the RNA sequencing results. The overall results from this study suggest that phthalates may possibly affect endometrial stromal cells and therefore female fertility. However, to gain a comprehensive understanding of the effect of phthalates on infertility, it is crucial to study both gene levels, protein levels, and conduct functional analyses.