Creation of Eternal Cells through FACS-assisted Genomic Engineering of Bacillus subtilis

Abstract

Bacillus subtilis er en modellorganisme innenfor bioteknologi som har blitt grundig studert over flere tiår og blitt brukt i en rekke industrielle sammenhenger. Bakterien har evnen til å gjennomgå sporedannelse i tillegg til forskjellige fysiologiske og morfologiske endringer som respons på ekstern stimuli. Dette prosjektet har som mål å utnytte disse egenskapene til å fjerne replikasjonsorigo (ori) og skape en populasjon av bakterieceller som ikke kan replikere, referert til som eternal cells. Disse cellene ville vært et interessant forskningstema, da deres oppførsel kan være betydelig annerledes. Replikasjon er et konsept som er grunnleggende for livet, da det tillater organismer å overføre sin genetiske informasjon til avkommet sitt. Muligheten til å skape ikke-replikerende celler kan åpne nye forskningsområder og utfordre vår forståelse av hva det vil si å være i live.

For å skape eternal cells ble det sporulasjonsinduserte SprAB-rekombinasjonssystemet brukt til å fjerne ori. En bakteriestamme ble konstruert til å inneholde to festepunkter for rekombinase-enyzmet som flankerer ori. SprAB-rekombinasen binder til festepunktene og fjerner sekvensen mellom dem. På begge sider av festepunktene er et kløyvet grønt fluorescerende protein (sfGFP)-gen som er fusjonert til et protein på overflaten av sporen. Ved eksisering av ori blir sfGFP-genet rekombinert, slik at det kan uttrykkes på sporeoverflaten. Sporulasjon vil dermed resultere i eksisering av ori og skapelsen av fluorescerende sporer. Ved å bruke fluorescensaktivert cellesortering (FACS) kan de fluorescerende sporene isoleres. Isolerte eternal cells kan deretter germinere og skape en populasjon av ikke-replikerende celler som kan studeres.

Optiske tetthetsmålinger av bakteriestammen ble gjennomført under dyrking og sporeproduksjon, og viste at den konstruerte bakteriestammen oppførte seg likt som villtypen. FACS-målinger etter nivå av fluorescens med fem replikater av den konstruerte stammen viste en fluorescerende populasjon på: 1,45%, 1,32%, 1,45%, 1,05% og 1,41%. To av de FACS-sorterte prøvene ble spredt på agarplater for å gro. Omtrent 16 667 og 50 000 sporer av hvert replikat ble tillatt å gro. Etter inkubasjon over natten var det vekst på platene tilsvarende en vekstrate på sporene som ble spredt på 0,068% og 0,181%, noe som karakteriseres som forurensning.

Disse resultatene indikerer at det er mulig å produsere eternal cells ved bruk av SprAB rekombinasjonssystemet med utbytter som overstiger tidligere systemer. I tillegg har dette systemet en redusert forekomst av forurensning sammenlignet med tidligere systemer brukt. Videre arbeid er nødvendig for å lokalisere årsaken til forurensningen ved å optimalisere sorteringskriteriene på cellesortereren. Fremtidige undersøkelser av oppførselen til disse ikke-replikerende cellene kan føre til nye oppdagelser og gi nye innsikter i livets grunnleggende egenskaper.

Bacillus subtilis is a model organism in biotechnology, being thoroughly studied over the span of decades and used in a variety of industrial applications. The bacterium has the ability to undergo sporulation and exhibit various physiological and morphological changes in response to environmental cues. This project aims to utilize these abilities to remove the origin of replication (ori), creating a population of cells that are not able to replicate - eternal cells. These cells would be an interesting topic of research, as their behavior may be vastly different. The concept of replication is fundamental to life, as it allows organisms to pass their genetic information to their progeny. However, the ability to create non-replicating cells could open up new avenues of research and challenge our understanding of what it means to be alive.

In order to create eternal cells, the sporulation-induced SprAB recombination system was used to excise the ori. The strain was constructed to contain two recognition sites flanking the ori. The SprAB recombinase binds to the recognition sites and excises the sequence between them. Flanking both of the recognition sites is a cleaved Green Fluorescent Protein (sfGFP) gene fused to a spore coat protein. Upon excision of the ori, the sfGFP gene is recombined, allowing it to be expressed at the surface of the spore. Sporulation will thus result in excision of the ori and creation of fluorescent spores. Using fluorescence-activated cell sorting (FACS), the fluorescent spores can be isolated. The isolated eternal cell spores can thus be allowed to germinate, creating a population of non-replicating cells that can studied.

Optical density measurements of the strain were conducted during cultivation and spore production, showing that the constructed strain behaved similar to the wild type. Sorted by level of fluorescence, five replicates of the constructed yielded a fluorescent population of: 1.45%, 1.32%, 1.45%, 1.05%, and 1.41%. Two of the FACS-sorted samples were spread on Agar plates to germinate. Approximately 16 667 and 50 000 spores of each replicate were allowed to germinate. After incubation overnight, there was growth on the plates corresponding to: 0.068% and 0.181% growth rate of the spores spread, which is characterized as contamination.

These results indicate that it is possible to produce eternal cells with the SprAB recombination system with yields that exceed earlier systems. Additionally, this system has a reduced rate of contamination compared to earlier models. Further work is needed to pinpoint the cause of contamination by optimizing the sorting gates on the cell sorter. Future investigations into the behavior of these non-replicating cells can lead to novel discoveries and provide new insights into the fundamental properties of life.