Metodeutvikling og validering av en kvantitativ UHPLC-MS/MS metode for analyse av tuberkulostatika i serum

Abstract

Tuberkulose er en infeksjonssykdom som krever omfattende behandling med flere typer antibiotika over lengre tid (minst seks måneder). Det er risiko for terapisvikt og toksiske effekter, og terapeutisk legemiddelmonitorering kan benyttes for å redusere dette. I dette masterprosjektet har det blitt utviklet en metode for prøveopparbeidelse og kvantitativ analyse av de fire førstelinje tuberkulostatika: rifampicin, pyrazinamid, isoniazid og etambutol. Metoden inkluderer også metabolitten acetylisoniazid, som kan brukes for å avdekke raske og trege acetylerere. Prøveopparbeidelsen er automatisert ved hjelp av Hamilton Star pipetteringsrobot og benytter proteinfelling i kombinasjon med en Ostro™-fosfolipidfjerningsplate. Prøvevolumet var 50 μL, og fellingsreagensen som ble brukt var iskald acetonitril tilsatt 1 % maursyre. Analysemetoden benytter Ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS). Kolonnen som ble brukt er en ACQUITY UPLC BEH C8-kolonne (2,1 x 50 mm, 1,7 μm, Waters) med mobilfase 0,1 % FAc i vann og metanol. Injeksjonsvolumet var 0,25 μL og total analysetid 3,5 minutter. Metoden ble validert og viser gode resultater med hensyn til nøyaktighet og presisjon. Ioniseringen i massespektrometeret ble gjort med elektrosprayionisering i positiv modus (ESI+). Isotopmerkede internstandarder (IS) ble brukt for alle analyttene: rifampicin-d4, pyrazinamid-15N,d3, isoniazid-d4, etambutol-d4 og acetylisoniazid-d4. Minste kvantifiserbare konsentrasjon (MKK) ligger mellom 0,25-10,0 μM, og minste detekterbare konsentrasjon ligger mellom 0,00125-0,125 μM. Kalibreringskurvene for analyttene følger en lineær kurvetilpasning innenfor målområdet, og kvadratisk utenfor måleområdet med vekting 1/x og ekskludering av origo (R/R2 ≥ 0,9988). Repeterbarheten innen en serie er høy med relativt standardavvik (RSD) ≤ 4,0 % for samtlige analytter. Repeterbarheten mellom serier var høy med RSD ≤ 4,9 % og nøyaktigheten som avvik fra teoretisk konsentrasjon ≤ 8,2 % for alle analytter. Matrikseffekter korrigert med IS lå mellom 94-124 %. Ekstraksjonsutbytte lå mellom 57-87 %. Isoniazid og acetylisoniazid viste grunnlinjeseparasjon med oppløsningsfaktor (RS) 1,56. Overdrag for alle analytter med unntak av rifampicin var < 20 % av signalet til MKK, for rifampicin er overdraget ca. 67 %. Samtlige av analyttene var stabile ved oppbevaring i serum ved -80 °C.

Tuberculosis is an infectious disease that requires extensive treatment with multiple types of antibiotics over an extended period (at least six months). There is a risk of treatment failure and toxic effects, and therapeutic drug monitoring can be utilized to reduce this risk. In this master's thesis, a method for sample preparation and quantitative analysis has been developed for the four first-line anti-tuberculosis drugs: rifampicin, pyrazinamide, isoniazid, and ethambutol. The method also includes the metabolite acetylisoniazid, which can be utilized to detect rapid and slow acetylators. Sample preparation is automated using the Hamilton Star pipetting robot and involves protein precipitation combined with an Ostro™ phospholipid removal plate. The sample volume is 50 μL, and the precipitation reagent used is cold acetonitrile with 1% formic acid. The analysis utilizes Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (UHPLC-MS/MS). The column used is an ACQUITY UPLC BEH C8 column (2.1 x 50 mm, 1.7 μm, Waters) with a mobile phase of 0,1% formic acid in water and methanol. The injection volume is 0.25 μL, and the total run time is 3.5 minutes. Ionization in the mass spectrometer was performed using electrospray ionization in positive mode (ESI+). Isotopically labeled internal standards (IS) were used for all analytes: rifampicin-d4, pyrazinamide-15N,d3, isoniazid-d4, ethambutol-d4, and acetylisoniazid-d4. The lowest quantifiable concentration (LOQ) ranges from 0.25 to 10.0 μM, and the lowest detectable concentration ranges from 0.00125 to 0.125 μM. The calibration curves for the analytes show linear fitting within the target range and quadratic fitting outside the target range with weighting 1/x and exclusion of the origin (R/R2 ≥ 0.9988). The repeatability within a series is high with relative standard deviation (RSD) ≤ 4.0% for all analytes. The repeatability between series is also high with RSD ≤ 4.9%, and the accuracy as deviation from the theoretical concentration is ≤ 8.2% for all analytes. IS-corrected matrix effects ranged from 94% to 124%. Recovery ranged from 57% to 87%. Isoniazid and acetylisoniazid exhibited baseline separation with a resolution factor (Rs) of 1.56. Carryover for all analytes, except rifampicin, was <20% of the signal at the LOQ, while rifampicin's carryover was approximately 67%. All analytes were stable when stored in serum at -80°C. Validation has shown that the method has high accuracy and precision and can be implemented in routine operation at the Department of Clinical Pharmacology (AKF) at St. Olav's Hospital.