| dc.description.abstract | Kiselalger er en gruppe encellede fotosyntetiserende mikroalger som finnes i marine og ferskvannshabitater. De står for en stor del av jordas primærproduksjon. I tillegg til å ha en viktig økologisk rolle, er kiselalger også en kandidat for produksjon av biodrivstoff, kosttilskudd, biokatalysatorer, bioplastikk og legemidler. Dermed er en god kunnskapsbase rundt kiselalgenes biokjemi og fysiologi en forutsetning for best mulig utnyttelse av organismen innen bioteknologi. En retning for optimalisering er økt effektivitet i nyttiggjørelse av lys og næringsstoffer i bioreaktorer. Dessverre er ikke kunnskapen om kiselalger på et høyt nok nivå i forhold til organismens potensielle bruksområder. Det har blitt observert at redusert størrelse på lysfangingsantennene assosiert med fotosystemene i kiselalger leder til økt effektivitet i biomasseproduksjon i større kulturer. Årsaken til dette er en redusert selv-skygning innad i kulturen når cellene ikke over absorberer lys med store antenne komplekser.
I andre fotosyntetiske organismer er et system kjent som ‘the chloroplast signal recognition particle pathway‘ (CpSRP) ansvarlig for transport av antennekompleksene inn i tylakoid-membranen. I kiselalger har det derimot blitt vist at selv om prosessen likner, bruker den et ukjent system for introduksjon av antennekompleksproteiner (AKP) etter translasjon i cytosol. ALB3 insertasene i modellorganismen P. tricornutum har blitt vist å ha en viktig rolle i innsettelsen av AKP-er i tylakoid membranen. Økt forskning på dette ukjente systemet vil kunne gi viktig kunnskap om hvordan fotosyntese og lystilpasning foregår i kiselalger.
I denne sammenheng ble fire gener, med genprodukt som er antatt å interagere med ALB3 insertasene (ALB3a og ALB3b) i P. tricornutum, utvalgt til CRISPR/Cas9 mediert «knock-out» (KO) mutasjon. Disse genene var et Pleckstrin homologi (PH) domene gen, et GTPase domene gen, og to gener som inneholder domener med ukjent funksjon, DUF1118 og DUF1350. Leserammemutantene som ble produsert for de tre sistnevnte genene hadde alle bare ett allel som kunne amplifiseres med PCR. Dette indikerer en stor mutasjon i det andre allelet. For det gjenværende PH domene genet skaptes bare enkeltallel med leserammemutasjoner selv for mutanter med mutasjon i begge allel, noe som kan hinte til at genet er essensielt.
Klorofyll fluorimetri og vekst analyse av GTPase, DUF1118 og DUF1350 mutantene gav en indikasjon av hvilke gener som vil være interessante for fremtidig arbeid, men grunnet et lavt antall med veldig like mutanter er resultatene som presenteres indikerende og ikke konklusive. Likevel, gir resultatene mulighet for fire anbefalinger for videre arbeid med disse genene: (1) det bør gjennomføres en helgenomsekvensering av mutantene for å verifisere mutantenes genotype, samt for å se om de har leserammemutasjoner i begge allel, (2) flere leserammemutanter burde skapes for videre arbeid med genene for å redusere risikoen for at observerte fenotyper er grunnet spesifikke sgRNA heller en gen KO-en, (3) det anbefales å gjennomføre en pigmentanalyse av mutantene da det viste seg at de har en reduksjon av klorofyll i forhold til villtypen under vekst i høylys, noe som kan være relatert til den observerte fenotypen i ALB3b KO mutantene, og (4) videre arbeid bør i hovedsak fokusere på GTPase genet da den hadde den sterkeste fenotypiske endringen og har et ortologt gen i Suaeda salsa med kjent funksjon og virkemåte som kan utforskes for kiselalge genet. | |
| dc.description.abstract | Diatoms are a group of unicellular photosynthetic microalgae widespread freshwater and marine habitats, and constitute a significant amount of the earths primary production. In addition to being an ecologically important group of organisms the class has also been suggested for use in bio-production of biofuels, nutraceuticals, bio-catalysts, bioplastics, and pharmaceuticals. As such, better knowledge of its biochemistry and biological pathways is necessary to optimize its use in biotechnological applications. One target for strain optimization is enhanced efficiency of light and nutrient utilization in bioreactor settings. However, the biotechnological potential of the diatoms is not matched by the level of knowledge of the organism’s physiology. It has been found that reducing the size of light harvesting antennae associated with the diatom’s photosystems increases efficiency of bioproduction in large batch cultures by reducing self-shading through prohibiting excessive absorption of light which cannot be utilized for photosynthesis, thereby increasing biomass production.
In other photosynthetic organisms a pathway known as the chloroplast signal recognition particle pathway is known to be responsible for insertion of the antenna complexes into the thylakoid membranes. However, in diatoms it has been shown that the process, although somewhat similar, makes use of a hitherto unknown pathway for post-translational transport of light harvesting complex proteins to the thylakoid membrane. The ALB3 insertases in the model diatom P. tricornutum have been shown to play a major part in the insertion of light harvesting complex proteins into the thylakoid membranes. Increased knowledge of this unknown pathway and its constituents would provide valuable knowledge about photosynthesis and light adaption in diatoms.
To this end, four genes whose gene products are suspected to function as interaction partners of the ALB3 insertases (ALB3a and ALB3b) in P. tricornutum were selected for knock-out (KO) using a CRISPR/Cas9 based system in this project. These genes were a Pleckstrin Homology (PH) domain gene, a GTPase domain gene, and two genes containing domains of unknown function, DUF1118 and DUF1350. Reading frame shift (RFS) mutants for the latter three of these genes could be achieved. For these mutants only a single allele of the targeted region could be amplified by PCR, indicating large mutations in the other allele. For the PH domain gene only monoallelic RFS mutants were obtained, hinting towards the PH domain gene being essential.
Pulse amplitude modulation fluorometry as well as growth curve measurements of GTPase, DUF1118 and DUF1350 mutants gave an indication of which genes will be interesting for further work, but due to low numbers of lines obtained as well as low diversity of mutants, the results in this project are only suggestive, and by no means conclusive. Based on the experiment results, four suggestions for further work were made: (1) conduct a full genome sequencing of the mutants to verify their genotype, and thus whether they are full KO mutants, (2) generate more KO mutants for genes interesting for further work to reduce the risk of sgRNA specific phenotypes rather than KO phenotypes, (3) perform a pigment analysis of the KO mutants as a reduction of chlorophyll intensity compared to the wildtype was observed and could be related to the observed phenotypic change in the ABLB3b KO mutant, and (4) to focus further work with the genes on the GTPase gene as it has the most distinct KO phenotype and an orthologous gene, in Suaeda salsa, with a known function and mode of action which can be investigated in P. tricornutum. | |