eDNA metodetesting av makroorganismer i marine habitater

Abstract

Framkomsten av eDNA-studier har vist seg å være en lovende metode for å utforske og forstå biologisk mangfold, spesielt innenfor marine miljøer som tradisjonelt har brukt inntrengende metoder for overvåkning av biodiversitet. Bruken av metabarcoding teknikker basert på 18S og 28S rDNA sekvensering har muligheten til å detektere et bredt utvalg av eukaryote arter, som er lite utforsket spesielt i marine økosystemer. Metoden er allikevel ikke problemfri, blant utfordringene er evnen til å skille nært beslektete arter fra hverandre og riktig tilordning av sekvenser, mens mangelen på standardiserte metoder og utfyllende referansedatabaser i marine miljø kompliserer dette ytterligere. Denne studien har som formål å etablere en metode for analyse av eDNA fra marine miljøprøver gjennom bruken av Ion Torrent PGM (Thermo Fisher) for NGS amplikonsekvensering av eDNA-prøver og utforsking av ulike bioinformatiske pipelines for å se hvordan justeringer av ulike parameterinstillinger påvirket etterbehandlingsresultatet av rådataene fra High Throughput Sequencing (HTS). Et sentralt problem som ble observert var begrensningen til SILVAngs sin referansedatabase, som gjorde at en betydelig mengde sekvenser ikke ble tilordnet en art. Ulike løsninger til dette ble derfor diskutert ytterligere, som blant annet omhandlet bruken av MetaZooGene sin North Atlantic All Marine Fauna 28S database for bedre artsklassifisering. Til tross for begrensningene bak metoden og forsøket, vil funnene bidra til en økt forståelse bak metoden samt hensyn som bør tas for marine studier av biodiversitet. Dette problemet påpeker viktigheten av metodeforbedring, som er spesielt relevant for databasemangler og standardisering av bioinformatiske pipelines. Det ble også gjort en sammenligning mellom marine sediment- og vannprøver, som detekterte variasjoner i antall taksonomiske tildelinger (TA) mellom prøvene. Det ble også gjort en sammenligning mellom to PCR-master mikser som viste seg å ha en effekt, VWR Taq DNA polymerasen viste høyere DNA amplikon konsentrasjoner enn det NEBNext Environmental Master Mix gjorde. Den største faktoren som hindrer pålitelig artsidentifikasjon i marine eDNA-studier, er underrepresentasjonen av marine eukaryoter i eksisterende referansedatabaser. Det er derfor viktig at et økende fokus rettes mot marine miljøer slik at disse problemene forbedres, og metoden pålitelig kan brukes i eDNA undersøkelser. Mangelen på interesse har bidratt til en begrenset forståelse av marine eukaryoter som understreker nødvendigheten for mer ressurser og forskning innenfor marine økosystemer. Denne studien avdekket at 28S rDNA-primeren kan fungere godt i fremtidige forsøk til kartlegging av marine eukaryote arter. 18S rDNA-primeren ble på sin side vurdert teoretisk siden primeren måtte kastes etter post-PCR kvalitetsvurderingen. Selv om et betydelig antall arter ble klassifisert som «no relative» grunnet mangler i databaser og ustandardiserte bioinformatikk-pipelines, viser funnene nytten av metoden og understreker viktigheten av å tilpasse den bioinformatiske analysen. For å forbedre effektiviteten av denne eDNA-metoden er det nødvendig med kontinuerlig utvikling og forskning innenfor feltet.

The advent of eDNA studies has emerged as a promising method to explore and understand biological diversity, especially within marine environments traditionally monitored by intrusive methods. Metabarcoding techniques based on 18S and 28S rDNA sequencing have the potential to detect a wide range of eukaryotic species, which are underexplored particularly in marine ecosystems. However, the method is not without challenges, including distinguishing closely related species and correctly assigning sequences. This is further complicated by a lack of standardized methods and comprehensive reference databases in marine environments. This study aimed to establish a method for analyzing eDNA from marine environmental samples using Ion Torrent PGM (Thermo Fisher) for NGS amplicon sequencing of eDNA samples and exploring different bioinformatics pipelines to understand how adjustments of various parameter settings influenced the post-processing results of High Throughput Sequencing (HTS) raw data. A central issue observed was the limitation of the SILVAngs reference database, leading to a significant number of sequences not being assigned to a species. Possible solutions were discussed, including the use of the MetaZooGene's North Atlantic All Marine Fauna 28S database for improved species classification. Despite the limitations of the method and experiment, the findings from this study will hopefully contribute to a better understanding of the method and considerations for marine biodiversity studies. This issue highlights the importance of method improvement, which is particularly relevant for database deficiencies and standardization of bioinformatics pipelines. Comparisons were also made between marine sediment and water samples, detecting variations in the number of taxonomic assignments (TA) between the samples. A comparison between two PCR master mixes also revealed a significant effect, with VWR Taq DNA Polymerase showing higher DNA amplicon concentrations than the NEBNext Environmental Master Mix. The largest factor hindering reliable species identification in marine eDNA studies is the underrepresentation of marine eukaryotes in existing reference databases. It is therefore crucial that increasing focus is placed on marine environments to improve these issues and the method can be reliably used in eDNA surveys. The lack of interest has contributed to limited understanding of marine eukaryotes, emphasizing the necessity for more resources and research within marine ecosystems. This study revealed that the 28S rDNA primer could function well in future attempts to map marine eukaryotic species. The 18S rDNA primer however, was assessed theoretically since the primer had to be discarded after post-PCR quality evaluation. The findings underline the usefulness of the method and emphasize the importance of adapting the bioinformatic analysis, although a significant number of species were classified as "no relatives" due to gaps in databases and non-standardized bioinformatic pipelines. To improve the efficiency of this eDNA method, continuous development and research within the field are necessary.