Identification of biomarkers for sulphur mustard exposure

Abstract

Sennepsgass er et kjemisk stridsmiddel som kan påføre skade på hud, øyer og respirasjonssystemet. Sennepsgass har blitt brukt i en rekke konflikter og stoffet ble sist brukt i Syria i 2015. Bruken av kjemiske våpen er strengt forbudt i henhold til kjemivåpenkonvensjonen. Dersom det mistenkes at kjemiske våpen er blitt brukt, er identifikasjon av biomarkører er viktig for å sikre både riktig behandling av pasienter og juridiske konsekvenser for den skyldige parten. Metoder for identifikasjon av biomarkører må ha høy sensitivitet og selektivitet.

En ny metode for identifikasjon av sennepsgassmetabolitter utskilt i urin ble utviklet i dette prosjektet. Metabolittene ble først ekstrahert fra urin med væske-væske-ekstraksjon og utsalting (SALLE). Deretter ble analyttene separert med hydrofile interaksjoner væskekromatografi (HILIC) og detektert med elektospray ionisering massespektrometri (ESI-MS).

HD-metabolittene undersøkt i dette prosjektet var hydrolyseproduktet thiodiglykol, β-lyase-metabolittene og cysteinylkonjugatet 1,1’-sulphonylbis[2-S-(N-acetylcysteinyl)ethane] (SBSNAE). β-lyasemetabolittene og SBSNAE er utvetydige biomarkører for sennepsgasseksponering. Ved å bruke væskekromatografi massespektrometri heller enn gasskromatografi massespektrometri, kan de tre β-lyasemetabolittene analyseres separat istedenfor samlet. Ved mistenkt sennepsgasseksponering er det er ønskelig å innhente mest mulig informasjon, også om relative mengder av de ulike biomarkørene som utskilles.

Det ble implementert en tidligere utviklet og publisert metode som tok i bruk fast fase ekstraksjon (SPE) og omvendt fase væskekromatografi (RPLC). SALLE-HILIC-ESI-MS metoden utviklet i dette prosjektet ble sammenlignet med den implementerte SPE-RPLC-ESI-MS metoden. Målet var å oppnå tilsvarende deteksjonsgrenser, men med kortere prøveopparbeidelse og analysetid.

Implementering av SPE som prøveopparbeidelse var velykket, og 2-4 ganger oppkonsentrering av analyttene ble oppnådd. Videre optimalisering av den publiserte LC-metoden førte til at analysetida ble tre ganger kortere.

SALLE ga kjapp og enkel opparbeidelse av urinprøver. HD-metabolittene ble ekstrahert med en mettet løsning av (NH4)2SO4 i 0.3:1 acetonitril/urin. Matrikskomponenter ble dessverre ikke like effektivt eliminert som ønsket, og det oppsto sannsynligvis noe ionesuppresjon ved deteksjon med ESI-MS.

Utvikling av HILIC-metoden fokuserte primært på valg av kolonne og optimalisering av mobilfasesammensetning. Retensjon av analyttene var utilstrekkelig på en SEQuant ZIC-pHILIC (2.1 x 150mm, 5 μm) kolonne. Derimot ble det oppnådd baselinjeseparasjon av alle analytter med en Acquity UPLC BEH Amide (2.1 x 150 mm, 1.7 μm) kolonne. Det ble bestemt at optimal mobilfase var 90% acetonitril og 10% vann med 20 mM ammoniumformat and 0.1% maursyre.

Ionekildeparametre for ESI-MS ble optimalisert for både HILIC og RPLC-separasjon, slik at best mulig response ble oppnådd. Kollisjonsenergier ble også optimalisert for bruk av tandem MS (MS/MS), men MS/MS-metoden ble ikke brukt for urinprøver.

Den optimaliserte RPLC-metoden hadde en analysetid på 9.5 minutter. Til sammenligning kunne de fem HD-metabolittene separeres på kun 2.5 minutter med den optimaliserte HILIC-metoden for vannprøver. Denne metoden ga imidlertid utilstrekkelig kolonnevask ved bruk til urinprøveanalyse.

Deteksjonsgrenser ble ikke etablert for noen av metodene. Observerbare konsentrasjoner ble estimert til å være mellom 1 ng/mL og 10 μg/mL for de fem analyttene med HILIC-metoden, og mellom 1 ng/mL og 100 ng/mL med RPLC-metoden.

Sulphur mustard (HD) is a chemical warfare agent (CWA) that may cause damage to the skin, eyes and respiratory tract. HD has been used in a number of conflicts, most recently in Syria in 2015. Use of chemical weapons is strictly prohibited by the Chemical Weapons Convention. Identification of biomarkers is crucial in the event of suspected CWA exposure, for ensuring appropriate treatment of the victims and legal ramifications for the guilty party. Methods for identification of CWA biomarkers must have high selectivity and sensitivity.

In this project, a new method for identification of urinary metabolites of HD was developed. HD-metabolites were first extracted from urine samples by salting out liquid-liquid extraction (SALLE), before separation by hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC), and detection by electrospray ionisation mass spectrometry (ESI-MS).

Investigated HD-metabolites were the hydrolysis product thiodiglycol, the β-lyase metabolites, and the cysteinyl conjugate 1,1’-sulphonylbis[2-S-(N-acetylcysteinyl)ethane] (SBSNAE). β-lyase metabolites and SBSNAE are unequivocal biomarkers of HD exposure. Use of liquid chromatography mass spectrometry rather than gas chromatography mass spectrometry allows for analysis of the three β-lyase metabolites separately, instead of as a combined reduction product. Obtaining as much information as possible, including relative amounts of excreted urinary biomarkers, is desirable in the event of suspected HD exposure.

A previously developed and published method using solid phase extraction (SPE) and reverse phase liquid chromatography (RPLC) was implemented. The SALLE-HILIC-ESI-MS method developed in this project was compared to the implemented SPE-RPLC-ESI-MS method, in the hope of achieving comparable detection limits with a faster sample preparation and a shorter analysis run time.

The SPE sample treatment method was successfully implemented, and a 2-4 times concentration of analytes was achieved. Further optimisation of the published LC gradient method gave a three times reduction in the analysis time.

SALLE provided quick and simple treatment of urine samples. HD-metabolites were extracted with a saturated solution of (NH4)2SO4 in 0.3:1 acetonitrile/urine. Unfortunately, matrix components were not eliminated as effectively as hoped, likely resulting in some ion suppression of the analytes with ESI-MS detection.

Development of the HILIC method focused primarily on column selection and optimisation of the mobile phase (MP) composition. Retention was found to be insufficient on a SEQuant ZIC-pHILIC (2.1 x 150 mm, 5 μm) column. Use of a Acquity UPLC BEH Amide (2.1 x 150 mm, 1.7 μm) column instead resulted in base line separation of all analytes. Optimal MP was determined to be 90% acetonitrile and 10% water with 20 mM ammonium formate buffer and 0.1% formic acid.

Ion source parameters for ESI-MS was optimised for both HILIC and RPLC separation in order to achieve maximum analysis response. Collision energies for tandem MS (MS/MS) analysis was also optimised, although the MS/MS method was not implemented for urine samples.

The analysis run time was 9.5 minutes with the optimised RPLC method. Separation of the five HD-metabolites was achieved in only 2.5 minutes with the HILIC method optimised for water samples. However, this method did not provide sufficient column wash when implemented for urine samples.

Detection limits were not established for either method. Observable concentrations in standard samples were estimated to be between 1 ng/mL and 10 μg/mL for the five analytes with the HILIC method, and between 1 ng/mL and 100 ng/mL with the RPLC method.