Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor type 1 and calcium in synaptic vesicles: Possible roles in regulation of synaptic function

Abstract

Synaptisk signallering i hjernen er prosessen der et nevron kommuniserer med et annen ved vesikkeleksocytose av et kjemisk transmitterstoff, som binder seg til reseptorer i den postsynaptiske membranen. Synaptisk overføring initieres gjennom en tilstrømning av kalsium til den aktive sonen til det presynaptiske nevronet. Denne tilstrømningen av kalsium er en av de viktigste presynaptiske faktorene i reguleringen av nevrotransmitterfrigjøring, og det er flere måter en økning i kalsiumkonsentrasjon kan skje på. Spenningsstyrte kalsiumkanaler (voltage-gated calcium channels; VGCC) øker de cytosoliske nivåene av kalsium gjennom tilstrømning fra det ekstracellulære rommet og har ofte blitt beskrevet som driverne for eksocytose. Likevel er VGCCs vanligvis plassert lenger unna den aktive sonen enn det som matematisk anses som en ideell avstand for å utløse eksocytose. Generelt sett, jo mer proksimalt kalsiumtilstrømningen til synaptiske vesikler er, desto høyere er sannsynligheten for frigjøring, på grunn av det høye antallet bufferorganeller som er tilstede i cellen. Nyere studier har indikert tilstedeværelsen av IP3R1, en kalsiumkanal, på synaptiske vesikler. Dette kan peke på at de synaptiske vesiklene har en svært proksimal kilde til kalsium, som potensielt setter dem i stand til å kontrollere sine egne frigjøringssannsynligheter. I denne oppgaven ble flere metoder brukt for å finne ut om synaptiske vesikler virkelig uttrykker IP3R1, og om disse synaptiske vesiklene også inneholder kalsium. Gjennom immunopresipitering og western blotting ble det funnet at IP3R1 er tilstede på synaptiske vesikler, og kvantitativ western blot viste at IP3R1 heterozygote knockout-mus har et signifikant lavere IP3R1-uttrykk på disse vesiklene enn villtypemus (p<0,001). Immunofluorescensavbildning viste at IP3R1-positive vesikler også inneholder kalsium. Ytterligere samlokalisering av den prosentvise forskjellen i kalsiumholdige synaptiske vesikler viste at heterozygote knockouts har et betydelig høyere antall kalsiumpositive vesikler sammenlignet med villtypemus (p<0,001). Dette kan tyde på at funksjonen til IP3R1 på synaptiske vesikler er å frigjøre kalsium fra vesiklenes lumen og inn i cytosol. Videre kan dette implisere IP3R1 som en potensiell modulator av frigjøringssannsynligheten til deres respektive synaptiske vesikler.

Synaptic transmission in the brain is the process by which one neuron communicates with another by vesicle exocytosis of a chemical transmitter substance, which binds to receptors in the post-synaptic membrane. Synaptic transmission is initiated through an influx of calcium to the active zone of the presynaptic neuron. This influx of calcium is one of the most important presynaptic factors in the regulation of neurotransmitter release, and there are several ways in which an increase in calcium concentration may happen. Voltage-gated calcium channels (VGCCs) increase the cytosolic levels of calcium through influx from the extracellular space and have commonly been described as the drivers of exocytosis. Nevertheless, VGCCs are usually located further away from the active zone than what is mathematically considered an ideal distance to trigger exocytosis. Generally speaking, the more proximal the calcium influx to synaptic vesicles, the higher the probability of release, due to the high number of buffering organelles present in the cell. Recent studies have indicated the presence of IP3R1, a calcium-release channel, on synaptic vesicles. This may point to the synaptic vesicles having a highly proximal source of calcium, potentially enabling them to control their own release probabilities. In this thesis, several methods were applied to ascertain whether synaptic vesicles really express IP3R1, and if these synaptic vesicles also contain calcium. Through immunoprecipitation and western blotting, it was found that IP3R1 is present on synaptic vesicles, and quantitative western blot showed that IP3R1 heterozygous knockout mice have a significantly lower IP3R1 expression on these vesicles than wild-type mice (p<0.001). Immunofluorescense imaging showed that IP3R1-positive vesicles also contain calcium. Further co-localisation of the percentage difference in calcium-containing synaptic vesicles showed that heterozygous knockouts have a significantly higher number of calcium-positive vesicles compared to wild-type mice (p<0.001). This may indicate that the function of IP3R1 on synaptic vesicles is to release calcium from the lumen of the vesicles and into the cytosol. Furthermore, this may implicate IP3R1 as a potential modulator of the release probability of their respective synaptic vesicles.