Using atomic force microscopy and second harmonic generation to investigate the effects of ultrasound and microbubbles on the extracellular matrix in 4T1 breast tumors

Abstract

For å forbedre leveringen av kreftmedisin til svulster har man sett at bruken av mikrobobler kombinert med ultralyd kan ha en positiv effekt. Denne typen behandling har vist seg å kunne øke distansen legemiddelet beveger seg i svulstens ekstracellulære matrise. Grunnen til dette er likevel ikke helt klar. I denne oppgaven er målet å se på effekten av mikrobobler og ultralyd på den ekstracellulære matrisen i 4T1 brystkreftsvulster.

Første del av oppgaven gikk ut på å optimalisere kurvetilpasning av kraftkurver ervervet ved hjelp av et atomkraftsmikroskop (AFM). Disse kurvene ble tilpasset ved bruk av Hertz model for å finne Young's modulus, et mål på stivhet. Fire forskjellige kontaktpunktsalgoritmer ble brukt, hvorpå én var en kombinasjon av de andre tre. Det var denne kombinerte strategien som ga det beste resultatet når 2703 kraftkurver fra ti 4T1 tumorer ble analysert, fem av tumorene var behandlet og fem var ubehandlet. Denne kontaktpunktsalgoritmen ble så brukt i all senere analyse. Tre forskjellige tilpasningsintervaller ble også undersøkt: én så på hele indenteringsdybden, én på de første 50\% av indenteringsdybden og én på de siste 50\% av indenteringsdybden. Her viste analysen at det å bruke hele indenteringsdybden var det beste valget for videre analyse, noe som ble styrket av at dette tilpasningsintervallet også fikk med seg all informasjon i kraftkurven.

I den andre delen av prosjektet ble verdiene for Young's modulus sammenlignet mellom ubehandlede og behandlede tumorer. Kollageninnholdet og organiseringen av kollagen ble også undersøkt. Dette ble gjort ved bruk av et multifotonlasermikroskop som tok i bruk det andreharmoniske signalet for å se på kollagen. Her ble det tatt bilder av hele tumorsnitt. Tre tumorsnitt per tumor ble avbildet. Fra disse bildene ble kollagentettheten kvantifisert ved å beregne fraksjonen av arealet i bildet som inneholdt kollagen. Organiseringen av kollagen ble kvantifisert ved å se på forholdet mellom transmittert og reflektert signal gjennom prøven (F/B ratio). Disse parameterne ble også sammenlignet mellom ubehandlede og behandlede tumorer. Ingen statistisk signifikante forskjeller ble funnet mellom de ubehandlede og behandlede tumorene for kollagentetthet, F/B ratio og Young's modulus. Korrelasjon mellom Young's modulus og kollagen ble også sett på, og en positiv statistisk signifikant trend ble funnet mellom Young's modulus og kollagentetthet. En svakere, ikke statistisk signifikant, positiv trend ble også funnet mellom Young's modulus og F/B ratio. Alle de målte parameterne viste også en svak trend til å være høyere i periferien enn i senter av tumorene.

Combining ultrasound and microbubbles for enhancing drug delivery has shown to increase the penetration length of drugs into the extracellular matrix, but the mechanism behind this is still not entirely clear. In this project, the effect of microbubbles and ultrasound on the extracellular matrix and tumor stiffness of 4T1 breast tumors has been investigated.

The first part of the project involved optimizing the curve fitting of force distance curves, obtained using an atomic force microscope (AFM). These curves were fitted with the Hertz model to obtain the Young's modulus, a measure of stiffness. Four different contact point algorithms were tested: goodness of fit, $\Delta$E, ratio of variances and a combination of the strategies. 2703 force curves were obtained from ten 4T1 breast tumors, five treated and five control. Analysis of these found that the combined strategies gave the best estimated contact point, and this was used in further analysis. Three different fit ranges were also tested: the entire indentation depth, the first 50\% of the indentation depth, and the last 50\% of the indentation depth. Analysis showed that using the entire indentation depth was the best choice, as it also included all the information of the force curve.

In the second part of the project the Young's moduli between control and treated tumors were compared. The collagen density and organization was also measured, by employing the principle of second harmonic generation (SHG) to image collagen using a multiphoton laser microscope. Entire tilescans of three tumor sections per tumor were obtained. The collagen density was quantified by calculating the collagen area fraction, and the collagen organization by calculating the ratio between the forward and backward propagating SHG signal. These parameters were also compared between control and treated tumors. No statistically significant differences was found between control and treated tumors for the Young's modulus, collagen density or the F/B ratio. The correlation between the Young's modulus and the collagen parameters was also investigated. It found a statistically significant positive trend between the Young's modulus and the collagen density, and a small, not statistically significant, positive trend between Young's modulus and F/B ratio. All parameters showed a tendency to be slightly higher in the tumor periphery than the tumor center.