Bacillus methanolicus MGA3 as host for methanol-based production of L-tryptophan-derived specialty compounds violacein, indole and tryptamine

Abstract

Interesse i bruk av en-karbon forbindelser, som metanol, som energikilde for produksjon av bioteknologiske relevante stoffer har økt de siste årene. Metanol er en lett tilgjengelig forbindelse som assimileres av en gruppe bakterielle arter kalt metylotrofer, og disse artene er lovende kandidater til å utfordre de mer vanlige industrielle produksjonsmetodene som avhenger av sukkerbaserte råstoff. Bacillus methanolicus MGA3 er en godt studert og karakterisert metylotrof som allerede har vist seg som en produksjonsvert for en rekke verdifulle stoffer. Denne studien har som mål å utforske potensialet til B. methanolicus MGA3 som produksjonsvert for tryptofan deriverte spesialstoffer violacein, indol og tryptamin. Violacein er et lilla pigment med interessante antibiotiske egenskaper syntetisert av vioABCDE operonet, naturlig funnet i blant annet Chromobacterium violaceum. Indol og tryptamin er signalstoffer involvert i flere biologiske prosesser og har blitt brukt i legemidler. Uttrykkssystemer basert på theta- og "rolling circle" replikerende plasmider med varierende kopinummer ble konstruert i dette arbeidet og transformert i B. methanolicus MGA3 med varierende suksess. Ingen produksjon av violacein kunne bli observert etter forsøk på flere kloningsstrategier med det violacein biosyntetiske operonet, sannsynligvis på grunn av den termofile temperaturen som kreves av produksjonsverten i motsetning til den psykrofile temperaturen der naturlige produsenter viser violaceinproduksjon. Det ble observert indikasjoner på indolproduksjon via kloning av det Escherichia coli-deriverte genet tnaA som koder for tryptofanase. Heterologt uttrykk av det Pseudomonas putida-deriverte antatte dekarboksylase-kodende genet PP_2552 for syntese av tryptamin behøver videre arbeid da dette prosjektet fortsatt er i kloningfasen. Resultatene fra dette arbeidet gir stor kunnskap for fremtidige prosjekter, rekombinante bakterielle stammer og plasmider konstruert i dette arbeidet kan bli utforsket videre.

Interest in utilising one-carbon compounds such as methanol as fuel for metabolically engineered organisms and their production of biotechnologically relevant compounds has increased in recent years. Methanol is an easily accessible compound readily assimilated by a group of bacterial species known as methylotrophs, and these serve as promising candidates to rival the more common industrial production methods that rely on sugar-based feedstocks. Bacillus methanolicus MGA3 is a well characterised methylotroph in which a number of value-added compounds have already been successfully produced. This study aims to explore the potential of B. methanolicus MGA3 as a production host for tryptophan-derived specialty compounds violacein, indole and tryptamine. Violacein is a purple pigment with interesting antibiotic properties synthesised by the vioABCDE operon, found naturally in species like Chromobacterium violaceum. Indole and tryptamine are signalling molecules involved in many biological processes and have seen usage in pharmaceuticals. Expression systems based on both theta- and rolling circle replicating plasmids with varying copy number were constructed in this study and transformed in B. methanolicus MGA3 with varying success. No production of violacein could be observed after attempting different cloning strategies with the violacein biosynthetic operon, likely due to the thermophilic temperature required by the production host as opposed to the psychrophilic temperature in which natural producers display violacein production. Indicators of indole production were observed via cloning of the Escherichia coli-derived tnaA gene encoding tryptophanase. Heterologous expression of the Pseuodomonas putidas-derived putative decarboxylase encoding gene PP 2552 for tryptamine synthesis requires further work as the project currently remains in the cloning stages. The overall results of this study provide great knowledge for future projects, recombinant bacterial strains and expression systems constructed in this study can be further explored.