| dc.description.abstract | Blokkpolysakkarider er en gruppe karbohydrater bestående av polysakkaridkjeder festet til hverandre ved hjelp av terminale bindinger til et linkermolekyl (b). Disse forbindelsene har en unik evne til å beholde egenskapene til sine individuelle polysakkarider, samtidig som de kan få nye makromolekylære egenskaper grunnet blokkstrukturen. Et eksempel på dette er den selvmonterende evnen til guluronat i guluronat-b-dekstran-diblokkstrukturer (Gn-b-Dexm). Tilsetning av et toverdig kation som Ca2+ kan indusere dannelsen av nanopartikler bestående av en guluronatbasert micellær kjerne og en dekstranbasert hydrofil korona.
Dette masterprosjektet hadde som mål å danne og karakterisere Gn, Dexm-PDHA og Gn-b-Dexm,
samt å oppskalere og utvikle metodene som brukes for å fremstille disse forbindelsene. Gn og Dexm-PDHA ble fraksjonert ved preparativ SEC, som viste seg å være et mer passende alternativ enn semi-preparativ SEC for fremstilling av Gn og Dexm-PDHA i større skala. Gn-b-Dexm-diblokker ble fremstilt i 3:1, 1:3 og 1:1-molforhold mellom de individuelle blokkene, Gn og Dexm-PDHA. Semi-preparativ SEC ble brukt til å fraksjonere G19-b-Dex135 (1:1) og G19-b-Dex40 (3:1) fra overskuddsreaktantene i deres respektive reaksjonsblandinger. G19-b-Dex40 ble med suksess fraksjonert fra overskuddsreaktanten G19. G19-b-Dex135 ble ikke separert fra Dex135-PDHA, da begge forbindelsene eluerte i ”voidvolumet”.
Etanolfelling ble utviklet som en alternativ metode til SEC for å separere Gn-b-Dexm fra overskuddsreaktanten Dexm-PDHA (1:3). Mikroplateanalyser viste at utfelling av Gn-b-Dexm og Dexm-PDHA startet ved ulike etanolkonsentrasjoner (respektivt 30 og 60%), noe som indikerte at det var potensial for å separere de to stoffene. Etanolfelling (40% etanol) ble utført på en reaksjonblanding bestående av Gn-b-Dexm og Dexm-PDHA, og 1H-NMR-analyser bekreftet at stoffene var separert. Dermed er etanolfelling en svært aktuell metode for separasjon av Gn-b-Dexm fra overskuddsreaktanten Dexm-PDHA. Metoden er enkel, effektiv og har potensial for å generere høye diblokkutbytter. I tillegg har metoden ingen molekylvektsbegrensning.
Sentrifugefiltrering ble utviklet som en metode for oppkonsentrering og avsalting av Gn, Dexm-PDHA og Gn-b-Dexm. Metoden ga høye utbytter (85-90%) og viste seg klart mindre tidkrevende enn dialysemetoden. Sentrifugefiltrering bør derfor regnes som en aktuell metode for oppkonsentrering og avsalting av guluronat- og dekstranoligomerer med DP > 13, samtidig som den bør uttestes for andre polysakkarider og lavere DP-er av guluronat og dekstran.
Prosjektets siste mål var å lage G19-b-Dex45-nanopartikler gjennom en Ca2+-indusert selvmonteringsmekanisme. Etter 24 timers dialyse mot Ca2+ var de pre-dialytiske G19-b-Dex45 populasjonene i intensitetsstørrelsesfordelingen erstattet av en enkelt populasjon med Z-gjennomsnitts diameter på 42 nm. Data fra dynamisk lysspredning og sammenligning med tidligere eksperimenter indikerte at G19-b-Dex45-nanopartikler bestående av en alginatbasert kjerne og en hydrofil dekstranbasert
korona hadde blitt dannet. Videre analyser antydet at nanopartiklene tålte en overgang fra salte forhold
(10 mM NaCl/20 mM CaCl2) til rent vann, i samsvar med tidligere studier. | |
| dc.description.abstract | Block polysaccharides are structures consisting of multiple polysaccharides attached to each other
by end-to-end coupling, with the help of a linker molecule b. These compounds have the unique ability to retain the inherent properties of its individual polysaccharides, while also obtaining new macromolecular properties due to the block structure. An example of this is the self-assembling ability of guluronate in guluronate-b-dextran (Gn-b-Dexm) diblock structures. Addition of a divalent cation like Ca2+ can induce the formation of nanoparticles composed of a guluronate-based micellar core and a dextran-based hydrophilic corona.
This project aimed to prepare and characterize Gn, Dexm-PDHA, and Gn-b-Dexm diblocks, as well as upscaling and developing the methods used in the preparation of these compounds. Gn and Dexm-PDHA conjugates were successfully fractionated by preparative SEC, which proved a more suitable option than semi-preparative SEC for the preparation of substantial amounts of the individual blocks. Gn-b-Dexm diblocks were prepared in 3:1, 1:3, and 1:1 molar ratios of Gn and Dexm-PDHA. Semi-preparative SEC was utilized to fractionate the respective reaction mixtures of G19-b-Dex135 (1:1) and G19-b-Dex40 (3:1), with varying results. G19-b-Dex40 was successfully fractionated from the reagent in excess, G19. G19-b-Dex135 was not separated from Dex135-PDHA as both compounds eluted in the void volume.
Ethanol precipitation was developed as an alternative to SEC fractionation for the recovery of Gn-b-Dexm diblocks from the reagent in excess, Dexm-PDHA (1:3). Microplate assays revealed that Gn-b-Dexm diblocks and Dexm-PDHA conjugates started to precipitate at ethanol concentrations of 30 and 60%, respectively. This considerable difference indicated that the compounds could be separated by precipitation at an ethanol concentration in the middle of the two values. Ethanol precipitation (40% ethanol) was performed on a diblock Gn-b-Dexm reaction mixture and characterized by 1H-NMR, verifying the complete separation of Gn-b-Dexm diblocks from Dexm-PDHA conjugates. These results consolidated ethanol precipitation as a simple and efficient alternative to SEC fractionation for the recovery of Gn-b-Dexm diblocks from Dexm-PDHA conjugates of the diblock reaction mixture. The method has the potential to generate high diblock yields and is not
restricted by the molecular weight of the sample.
Centrifugal filtration was developed as a method for the concentration and desalting of Gn, Dexm-PDHA, and Gn-b-Dexm diblocks. For Gn, Dexm-PDHA, and Gn-b-Dexm of DP > 13, the centrifugal filtration method generated high recovery yields of 85-90% and proved a far more efficient desalting method than the time-consuming dialysis method. The method should therefore be considered applicable for the concentration and desalting of mentioned compounds. It should be tested for guluronate and dextran oligomers of lower DP, as well as other polysaccharides, in order to determine whether it is viable for these compounds.
The final objective of the thesis was to prepare G19-b-Dex45 nanoparticles through a Ca2+-induced self-assembly mechanism. After 24 hours of dialysis against Ca2+, the multiple pre-dialytic populations of the G19-b-Dex45 intensity size distribution had been replaced by a single population with a Z-average diameter of 42 nm. Dynamic light scattering data before and after dialysis against Ca2+, as well as comparison with similar experiments, strongly implied the development of G19-b-Dex45 nanoparticles consisting of a guluronate-based core and hydrophilic dextran-based corona. Dynamic light scattering data also revealed that the nanoparticles endured a transition in conditions from 10 mM NaCl/20 mM CaCl2 to MQ water reasonably well, in accordance with earlier studies. | |