Metodeutvikling av sialinsyrefarging av humane celler med FITC-lektin og deteksjon ved fluorescensmikroskopi

Abstract

Oppgaven omhandler metodeutvikling for farging av sialinsyrer på humane celler. Vurdering av fargeresultatet ble gjort ved fluorescensmikroskopi. Sialinsyrer finnes på celleoverflaten til alle celler hos virveldyr, og et endret sialinsyremønster kan komme av patologiske tilstander. Det er derfor viktig å ha gode deteksjonsmetoder for disse strukturene. Lektiner konjugert til fluorokromer kan brukes til å påvise sialinsyrene. I denne oppgaven ble det brukt fluoresceinisotiocyanat konjugert til lektin (FITC-lektin) for påvisning av sialinsyrer.

En fargeprosedyre ble utarbeidet og videre optimalisert med tanke på fiksering, inkubasjonstid og konsentrasjoner av FITC-lektin. Laboratorieforsøket viste at fiksering i 4% formaldehyd i 15 minutter gav best resultat. Videre ble det funnet ut at preparatene som ble inkubert i 90 minutter og i lektinløsning med konsentrasjon på 20 µg/mL viste den beste fluorescensintensiteten. I tillegg ble holdbarheten til FITC-lektin testet, og det ble funnet ut at det er best å bruke ferskt reagens ved farging med FITC-lektin.

This thesis deals with method development for staining of sialic acids on human cells. Evaluation of the colour result was done by fluorescence microscopy. Sialic acids are found on the cell surface of all cells in vertebrates, and an altered sialic acid pattern can occur in pathological conditions. It is therefore important to have good detection methods for these structures. Lectins conjugated to fluorochromes can be used to detect the sialic acids. In this thesis, fluorescein isothiocyanate conjugated to lectin (FITC lectin) was used for detection of the sialic acids.

A staining procedure was developed and further optimised for fixation, incubation time, and FITC lectin concentrations. The laboratory experiment revealed that fixation in 4% formaldehyde for 15 minutes gave the best result. Furthermore, it was found that the samples incubated for 90 minutes in lectin solution with a concentration of 20 µg/mL presented the best fluorescence intensity. In addition to these parameters the shelf life of FITC lectin was tested, and it was found that it is best to use a fresh reagent when staining with FITC lectin.