Investigating the effects of osmotic stress and cellulose biosynthesis inhibition on cell morphology and plasma membrane tension in Arabidopsis thaliana using confocal microscopy and the mechanosensitive Flipper-TR

Abstract

Planter trenger et system for å oppfatte og tilpasse seg miljøet rundt, ettersom de ikke kan forflytte seg. Plantecellen er omgitt av en cellevegg som støtter opp planten strukturelt og mekanisk. Mekanismene for celleveggintegritetsvedlikehold gjør det mulig for plantecellen å overvåke celleveggens tilstand under vekst eller stress fra omgivelsene. Stresspersepsjon er derfor en viktig forutsetning for celletilpasning. Hypotesen som undersøkes i denne oppgaven er at plasmamembranen, eller komponenter forankret i plasmamembranen, er involvert i stresspersepsjon, som involverer forstyrrelser i det fysiske forholdet mellom plasmamembran og celleveggen. For å studere den synlige effekten av Isoxaben (ISX) og hyperosmotisk stress på Arabidopsis thaliana røtter, spirer som uttrykker SYP121-YFP, som merker plasmamembranen, ble kontroll-, sorbitol-, ISX- eller ISX + sorbitolbehandlet. Spirene var også farget med propidiumjodid for å farge celleveggen og observere celledød. I overensstemmelse med tidligere studier virker det som om sorbitol demper noe av effekten ISX har på cellene, selv om det ser ut til å være mer celledød hos spirer behandlet med ISX + sorbitol enn spirene som kun er behandlet med ISX. For å undersøke hva som skjer med plasmamembranspenningen i møte med stress ble fluorescens levetid mikroskopi (fluorescence lifetime imaging microscopy – FLIM) brukt til finne levetiden til Flipper-TR i Arabidopsis spirerenes plasmamembranen i epidermisceller. Flipper-TR har tidligere blitt brukt i dyreceller og gjærceller, men ikke i undersøkelser av planter. Forsøksbetingelser ble derfor først etablert før effekten av de tidligere nevnte behandlingene ble undersøkt. Resultatene av undersøkelsene viste at fire timer ISX-behandling gir en kortere fluorescens levetid sammenlignet med spirene som ble kontrollbehandlet. Til forskjell ga sorbitolbehandling en økning i levetid, også når det var i kombinasjon med ISX, som igjen antyder at sorbitol undertrykker effektene av ISX på spirene. Effekten av hyper-og hypo-osmotisk stress viste seg å ha motsatt effekt på fluorescens levetiden enn hva som tidligere har blitt observert i dyre- og gjærceller.

Plants, unable to flee from stress or danger due to their immobile existence, need a system to perceive and adapt to the environment. A cell wall surrounds the plant cell, giving structural and mechanical support to the plant. The cell wall integrity maintenance mechanism is enabling the plant cell to monitor the state of the cell wall during growth or environmental stress. Stress perception is therefore a prerequisite of cell adaption. The working hypothesis to be investigated here is that the plasma membrane, or components anchored to the plasma membrane are involved in stress perception, involving plasma membrane – cell wall continuum disruption. To study visible effects of Isoxaben (ISX) and hyper-osmotic stress on Arabidopsis thaliana roots, seedlings expressing SYP121-YFP, which labels plasma membranes, were mock-, sorbitol-, ISX-, or ISX + sorbitol-treated. In addition, they were stained with propidium iodide to label cell walls and detect cell death. In accordance with other studies, sorbitol seems to hinder some of the effect ISX has on the cells, though there seems to be more cell death in ISX + Sorbitol-treated seedlings than in those treated only with ISX. To investigate what happens to plasma membrane tension in response to stress, fluorescence lifetime imaging microscopy was used to measure the lifetime of Flipper-TR in the epidermal plasma membrane of Arabidopsis seedlings. Flipper-TR has previously been used in mammalian cells and yeast cells but not in plants. Therefore, experimental conditions were first established before the effects of the same treatments as before were determined. ISX-treatments shorten the fluorescent lifetime compared to mock controls after around 4 hours. In contrast sorbitol-treatments increase the lifetime, also when combined with ISX, again implying sorbitol suppress the ISX effects on the seedling. Interestingly, the effect of hyper- and hypo-osmotic stress were found to have the opposite effect on the lifetime than what has been described previously in mammalian and yeast cells.