The role of TDG-mediated DNA demethylation in the entorhinal-hippocampal spatial representation system

Abstract

Hukommelsestap og kognitive svekkelser er ofte sett med aldring. Degenerasjonen sees ofte i sammenheng med epigenetisk endring, som i DNA metylering og demetylering. Flere studier som omhandler 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) nivå under utvikling er blitt utført, men få er gjort i sammenheng med nivåer av mellomprodukter fra DNA demetylering ved aldring. Ved å undersøke TDG-mediert DNA metylering ved aldring i entorhinal cortex og hippocampus kan vi få et innblikk i om DNA demetylering er en viktig molekylær mekanisme som ligger til grunn for aldersavhengige kognitive svikt.

Det første målet i dette studie er å undersøke om nivå av mellomprodukter fra DNA demetylering akkumuleres ved aldring. Jeg vurderer nivået av 5-formylcytosin (5fC) og 5-karboxylcytosin (5CaC) i mediale entorhinal cortex (MEC) og i hippocampus (HPC) til unge (3 måneder gamle) og eldre (18 måneder gamle) mus ved hjelp av immunhistokjemi (IHC) og konfokal mikroskopi. 3D analyse av konfokale bilder ble utført i programvaren IMARIS. Jeg fant en signifikant økning av 5fC og 5CaC nivåer i eldre MEC og CA1, sammenlignet med unge, som indikerer at både 5fC og 5CaC akkumuleres i MEC og HPC ved aldring.

Ettersom mellomproduktene fra DNA demetylering (5fC og 5CaC) blir fjernet av tymin-DNA-glykosylase (TDG) mediert eksisjonsreparasjon (BER), er det andre målet med studiet å etablere en pålitelig metode for manipulering av TDG uttrykkelse i nevroner, ved å bruke Cre-loxP systemet. For dette formålet evaluerer jeg rAAV-Cre-indusert fjerning av TDG i hippocampus regionene til LoxP-MiniTdg +/+ mus ved hjelp av IHC. Antistoffene som ble brukt er spesifikke for GFP, modne nevroner, astrocytter og mikroglia. Jeg oppdaget at rAAV-Cre viral injeksjoner med 1:5 og 1:10 fortynning førte til tap av nevroner i sammenheng med eskalert aktivering av GFAP-positive astrocytter og Iba1-positive mikroglia. Injeksjoner av rAAV-Cre virus med en fortynning på 1:20 viste jevn uttrykkelse av Cre-indusert GFP i både pyramidale og granulære cellelag, med begrenset tap av nevroner og immunrespons. I tillegg ble RT-qPCR utført for å evaluere TDG-nivåene etter rAAV-Cre injeksjoner, men kun et pilotforsøk ble utført. Jeg fikk ingen pålitelige resultater som viser mangel av TDG på grunn av begrenset antall prøver.

Til oppsummering antydet arbeidet mitt at (i) Mellomprodukter av DNA demetylering, som 5fC og 5CaC, ble akkumulert i nevroner i MEC og HPC ved aldring; (ii) 1:20 rAAV-Cre injeksjon sikrer den mest effektive fjerningen av TDG i hippocampus regionen ute å introdusere andre bivirkninger som vevslesjoner og immunrespons.

Cognitive impairments and memory decline are commonly seen with aging. The decline is often seen with epigenetic alterations, such as in DNA methylation and demethylation. Studies on 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) levels during development have been performed, but there are few considering altered DNA demethylation intermediate levels during aging. By investigating TDG-mediated DNA demethylation during aging in the entorhinal and hippocampal region, we can get an insight in whether DNA demethylation is an important molecular mechanism underlying age-dependent cognitive impairments.

In this study, the first aim is to investigate whether DNA demethylation intermediates are accumulated during aging. I assess the level of 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5CaC) in the medial entorhinal cortex (MEC) and in the hippocampus (HPC) of young (3 months old) and aged (18 months old) mice by Immunohistochemistry (IHC) and confocal microscopy. Confocal images were analyzed in 3D by IMARIS Cell imaging software, and the statistical analysis was performed in GraphPad Prism. I found that levels of 5fC and 5CaC were significantly increased in aged MEC and CA1 when compared to young, indicating that both 5fC and 5CaC are accumulated in MEC and HPC during aging.

As these DNA demethylation intermediates (5fC and 5CaC) are excised by thymine DNA glycosylase (TDG)-mediated DNA base excision repair (BER) pathway, the second aim of this study is to establish a reliable method for the conditional manipulation of TDG expression in neurons using the Cre-loxP system. For this purpose, I assess rAAV-Cre induced TDG-depletion in the hippocampal region of LoxP-MiniTdg+/+ mice by IHC. Antibodies specific for GFP and markers of mature neurons, astrocytes and microglia were used in this study. I found that injection of the rAAV-Cre viral stock with a dilution of 1:5 and 1:10 led to neuronal loss along with an escalation of activated GFAP-positive astrocytes and Iba1-positive microglia. Injection of the rAAV-Cre viral stock with a dilution of 1:20 showed nice Cre-induced GFP expression in both pyramidal and granular cell layers, with limited neuronal loss and immune response. In addition, RT-qPCR was performed to evaluate the TDG-levels after depletion, but only a pilot experiment was performed. I did not get any reliable results showing TDG depletion due to limited sample size.

Taken together, my work suggests that (i) DNA methylation intermediates such as 5fC and 5CaC were accumulated in MEC and HPC neurons during aging; (ii) 1:20 rAAV-Cre injection ensures the most efficient TDG depletion in the hippocampal region without introducing other side effects such as tissue lesions and immune response.