Evaluation of S. lividans ΔmatAB as a host for production of lytic polysaccharide monooxygenases

Abstract

Med en stadig økende befolkning, øker også behovet for energi. I dag blir i all hovedsak dette behovet dekket med energi fra fossilt brennstoff. Selv om bruk av ikke-fornybare kilder reduseres, er det fortsatt et behov for å finne bedre løsninger for å redusere utslipp av klimagasser. Det å benytte biodrivstoff som et alternativ til fossilt drivstoff er med på å redusere disse utslippene. Brenning av biodrivstoff, er klimanøytralt som følger av at utslippene allerede er en del av naturens eget kretsløp. I dag blir første generasjons biodrivstoff produsert i stor skala ved bruk av landbruksvekster som råstoff. Andre generasjons biodrivstoff er produsert ved bruk av lignocellulosisk biomasse fra ulike typer avfall. I motsetning til første generasjons biodrivstoff, går ikke andre generasjons biodrivstoff på bekostning av matvareproduksjonen. Produksjon av biodrivstoff ved bruk av lignocellulose er en krevende prosess. Det å tilsette lytisk polysakkarid monooksygenaser (LPMO-er), har vist seg å gjøre nedbrytningen av lignocellulose mye mer effektiv. Det vil være nødvendig å benytte rekombinant produksjon av protein for å kunne produsere LPMO-er i stor skala. I industrien er det ofte Escherichia coli (E. coli) som blir benyttet som vertsorganisme for produksjon av rekombinante proteiner. E. coli er en modellorganisme som er enkel å manipulere og den har flere fordeler ved kultivering. Likevel er det enkelte utfordringer ved å bruke E. coli som vertsorganisme. Enkelte rekombinante proteiner lar seg ikke uttrykke i denne vertsorganismen, samtidig som produksjon av proteiner ofte kan resultere i inklusjonslegemer. E. coli mangler også muligheten for post-translasjonelle modifikasjoner som glykosylering. På grunn av disse utfordringene har det derfor vist seg at det er nødvendig å finne andre vertsorganismer, for produksjon av rekombinante proteiner. I dette prosjektet ble Streptomyces lividans (S. lividans) benyttet for å produsere en LPMO kalt CelS2. S. lividans har muligheten til å glykosylere det produserte proteinet, i tillegg til at vertsorganismen kan utføre sekresjon av protein ut i mediet. Denne egenskapen er av stor verdi i videre nedstrømsbehandling. Arbeidet som blir presentert i denne oppgaven viser at produksjon av CelS2 i S. lividans var vellykket. To ulike vektorer ble konstruert for å uttrykke proteinet; pL99-SPsc-CelS2-strep og pL99-SPsc-CelS2-strep-linker. Strep-tag II ble benyttet som et alternativ til His-tag. Dette på grunn av at His-tag tidligere har vist å forårsake bireaksjoner, som følge av dens affinitet for metallioner. Sekresjon av protein ut i mediet ble oppnådd ved å benytte SPsc som signalpeptid. Det produserte proteinet ble evaluert med både SDS-PAGE og western blot. Resultatene viser at det produserte proteinet har riktig størrelse og antistoffet, som binder seg til affinitetsmerkingen, ble detektert. Rensing ble gjennomført med affinitetskromatografi, for å kunne karakterisere proteinet. Selv om produksjonen av proteinet var vellykket, ble utbyttet etter rensing lavere for både CelS2-strep og CelS2-strep-linker, sammenlignet med rensing av CelS2-his i tidligere forsøk. Glykosylering av CelS2-strep ble evaluert med massespektrometri, og det kan ut fra de gitte resultatene antas at proteinet er glykosylert. Streptomyces har i dette prosjektet vist seg å være et godt alternativ som vertsorganisme for produksjon av LPMO-er.

The world's energy needs increase with an increase in the world population. Today, the need for energy is mainly covered by energy from fossil fuels. Even though there is a decrease in the use of non-renewable sources, there is still a demand to find better solutions and reduce the emission of greenhouse gasses. Using biofuels as an option for fossil fuels has the potential to reduce some of these emissions. Combustion of biofuels is accepted as a climate-neutral option since it already is a part of nature's own cycle. Today the first generation of biofuels are produced on a large scale using agricultural crops as the raw material. The second generation of biofuels are produced from lignocellulosic biomass from different kinds of waste. Unlike the first generation biofuels, the second generation biofuels are not at the expense of the production of food. Production of biofuels using lignocellulose as the raw material is a demanding process. To make the process for degradation of lignocellulose even more efficient, the addition of lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs), has given promising results. It would be necessary to use recombinant production of the protein for production of LPMOs on a large scale. Production of recombinant proteins is mainly achieved using Escherichia coli (E. coli) as a host. E. coli is a model organism that is easy to manipulate and has a variety of benefits upon cultivation. Even though E. coli has been shown to be a good host for the production of recombinant proteins, there are some challenges and disadvantages using this bacteria. Some proteins are not able to be expressed in this host and the production of proteins may lead to the formation of inclusion bodies. In addition, E. coli do not have the ability to implement post-translational modifications, such as glycosylation. As a result of this, it is necessary to find other hosts for production of those recombinant proteins. In this project, Streptomyces lividans (S. lividans) was used to produce the LPMO CelS2. S. lividans can potentially glycosylate the produced protein, in addition to secreting the protein into the culture medium. Secretion is very valuable for downstream processing. The work presented in this thesis shows that the production of CelS2 in S. lividans was successful. Two vectors were constructed to express the protein of interest: pL99-SPsc-CelS2-strep and pL99-SPsc-CelS2-strep-linker. The Strep-tag II was used as an affinity tag since previous studies has shown that the His-tag causes inconvenient reactions in LPMOs, due to its affinity for metal ions. Secretion of the protein into the culture medium was achieved using SPsc as a signal peptide. The produced proteins were evaluated with both SDS-PAGE and western blot. The results show that the produced proteins were of the right size (36 kDa) and the antibody which binds to the affinity tag was detected. To characterize the protein, purification was conducted with fast protein liquid chromatography (FPLC). Even though the production was successful, the yield after purification was lower for both CelS2-strep and CelS2-strep-linker, compared with purification of CelS2-his in previous study. Glycosylation of CelS2-strep was evaluated by mass spectrometry and it can be assumed to be glycosylated. Streptomyces has in this project shown to be a good alternative as a host to produce LPMOs.