Etablering av Real-Time PCR for deteksjon av Cutibacterium acnes

Abstract

Cutibacterium acnes er en gram positiv, anaerob stavbakterie som inngår i hudens normalflora. Bakterien kan være årsak til postoperative infeksjoner, da bakterien fester seg til proteser og kirurgisk utstyr. Per i dag benyttes sekvensering og dyrkning til diagnostikk av Cutibacterium acnes. Dette er to tidkrevende metoder sammenlignet med real time-PCR, og det var derfor ønskelig å utvikle en hurtigere og spesifikk real-time PCR for deteksjon av Cutibacterium acnes.

For etablering av metoden ble et område på 16S rRNA-genet, i region V1-V2, benyttet for fastsettelse av probe- og primersekvenser. Primere ble levert fra leverandørene Invitrogen og TIB Molbiol. Det ble benyttet prober fra henholdsvis TIB Molbiol og Applied Biosystems UK, og kombinasjoner av primere og prober ble undersøkt i tre ulike metodeoppsett; - Metodeoppsett 1: Primere og TaqMan probe fra TIB Molbiol - Metodeoppsett 2: Primere fra Invitrogen og TaqMan probe fra Applied Biosystems. - Metodeoppsett 3: Primere fra Invitrogen og TaqMan MGB probe fra Applied Biosystems. Positiv kontroll ble hentet fra renkultur etter oppvekst fra pasientmateriale, hvor bakterien i forkant var blitt identifisert ved bruk av MALDI-TOF massespektrofotometri. For utprøvingen har det blitt benyttet 41 kliniske prøver.

Det ble utført blant annet gradientanalyse for temperaturoptimalisering, effektivitets-, spesifisitets- og, sensitivitetsanalyse foruten kontroll av PCR-produkt ved kapillærelektroforese, og bestemmelse av metodens deteksjonsgrense. Cutibacterium acnes er kjent for å være til stede i luft og øvrig miljø. Det ble tidlig avdekket at kontaminasjon ikke kunne unngås, men måtte tas høyde for ved vurdering av resultatene. Vi fant at Metodeoppsett 3 viste god spesifisitet, en PCR-effektivitet på tilnærmet 100% og en akseptabel sensitivitet med en deteksjonsgrense på 171,2 kopier/PCR. Basert på våre resultater ble det konkludert med at Metodeoppsett 3 kan tas i bruk ved AMM. Det anbefales imidlertid ytterligere validering av Metodeoppsett 3 før det tas i bruk.

Cutibacterium acnes is a gram positive, anaerobic rod-shaped bacterium which is normally present in human skin. The bacteria can cause post-operative complications, primarily by attaching to prostheses and surgical equipment. Today Cutibacterium acnes is identified by either cultivation or sequencing. Both methods are time consuming compared to a real-time PCR method. Thus, the aim of this study was to establish a specific real-time PCR method for detection of Cutibacterium acnes.

The target gene used to detect Cutibacterium acnes was localized in region V1-V2 on the 16S rRNA-gene. Primers were ordered from Invitrogen and TIB Molbiol. TaqMan-probes were ordered from TIB Molbiol and Applied Biosystems UK. The primers and probes were combined and constituted three different methodological setups: - Setup 1: Primers and TaqMan-probe from TIB Molbiol - Setup 2: Primers from Invitrogen and TaqMan-probe from Applied Biosystems. - Setup 3: Primers from Invitrogen and TaqMan MGB-probe from Applied Biosystems. The positive control was gathered from a bacterial culture containing Cutibacterium acnes. The culture originated from a patient sample and was identified by using MALDI-TOF mass spectrometry. 41 clinical specimens were examined.

The establishment of a new PCR-method includes a gradient analysis for temperature optimization, analysis of efficiency, specificity and sensitivity, control of obtained PCR-product by using capillary electrophoresis, and determination of the detection borderline. Cutibacterium acnes is known to be present in the environment. It was early discovered that the assays were contaminated by Cutibacterium acnes, and this had to be considered when the results were evaluated. Our results showed that Setup 3 is the most prominent for detection of Cutibacterium acnes. The assay is specific, has an efficiency of approximately 100% and an acceptable sensitivity. The detection borderline was found to be 171,2 copies/PCR. Based on our results, it was concluded that Setup 3 can be used for medical diagnostics. However, further validation of Assay 3 is recommended before use.