| dc.description.abstract | Bakgrunn: Mycobacterium avium er en non-tuberkuløs mykobakterie (NTM), som er nært beslektet med Mycobacterium tuberculosis, som gir NTM lungesykdom. NTM infeksjon er vanskelig å behandle og krever en behandling med flere ulike antibiotika ofte brukt i høye doser over en lengre periode. De alvorlig bivirkningene øker sjansen for et dårlig resultat av behandlingen og eksponerer pasienter til utviklingen av resistans. Sammen med den økende prevalensen i vestlige utviklede land, er det et økende behov for utvikling av alternativ behandling. Host directed therapy (HDT) er en annen behandlingsform som legger til flere legemidler, som påvirker prosesser i kroppen, sammenlignet med standard antibiotika behandling. Denne behandlingen er sett på som fordelaktig, da den øker livskvaliteten ved å redusere antall antibiotika, samtidig som man får et bedre resultat.
Mål: I denne masteroppgaven forsøkte vi å utvikle en plattform for bildeanalyse og innsamling av bilder.
Gjennom justering av mikroskop og eksperimentering med cellesegmenterings verktøy ble det utviklet en plattform. For å validere plattformen ble et bibliotek av 10 ulike forbindelser testet. Bakgrunnen var for å se om noen av forbindelsene påvirket veksten av M. avium.
Metode: Peripheral blood mononuclear cell (PBMCs) ble isolert fra buffy coat, og monocyttene ble differensiert til makrofager over 6 dager med bruk av makrofag-kolonistimulerende faktor (M-CSF). Makrofagene ble infisert med M. avium 104 stamme som inneholdt DsRed, og behandlet med biblioteket.
Ved bruk av konfokalt mikroskop ble det tatt bilder som ble analysert ved bruk Cellpose og ImageJ, for å måle intensiteten av fluorescens. Intensiteten av fluorescens ble sammenlignet ved bruk av ANOVA test.
Resultat: Cellpose ble valgt som en lovende algoritme, med mål om å redusere tiden brukt på analyse og øke nøyaktigheten av celle segmentering. Ulike metoder for å overføre data fra Cellpose til ImageJ ble undersøkt. Bruken av et script fra Github viste seg å være den løsningen som ga best resultat i henhold til både tidsbruk og nøyaktighet. For å gi enda bedre resultat ovenfor cellesegmentering vil en bedre protokoll for farging av cellene være fordelaktig for spare tid ytterlige og oppnå en høyere grad av nøyaktig. Et bytte fra central processing unit (CPU) til graphics processing unit (GPU) er anbefalt for å korte tiden ytterligere.
ANOVA viste at alle 10 forbindelser hadde en lavere vekst av bakterien sammenlignet med ingen behandling, derav noen bedre enn andre. Metformin, GW9662, og zileuton viste den beste effekten sammenlignet med ingen behandling og er vurdert som de beste kandidatene. 2-aminopurine (2-AP), simvastatin og mepenzolate viste den dårligste effekten. Disse resultatene var derimot imot ikke statistisk signifikant forskjellig fra kontrollen. Både simvastain og metformin i kombinasjon med antibiotika viste en statistikk signifikant lavere bakterie vekst sammenlignet med ingen behandling, og hadde justerte p-verdier på 0.0008 for simvastatin og 0.0070 for metformin. Det var derimot ingen statistisk signifikant forskjell mellom kombinasjonsbehandlingen og antibiotika alene.
Konklusjon: Bruken av HDT er et lovende behandlingsalternativ i M. avium infeksjon. Fra resultat så man at metformin, GW9662 og zileuton ser ut som de mest lovende kandidatene, mens 2-AP, simvastatin og mepenzolate viste å ha lavest effekt. Disse resultatene var derimot imot ikke statistisk signifikant forskjellig fra kontrollen, men viste likevel en tendens. Få donorer ble undersøkt, så det er en sjanse for variasjon i resultat som bør taes hensyn til når resultatet vurderes.
Utviklingen av plattformen var vellykket. Cellpose viste seg å være en god algoritme for segmentering av cellene. Det er derimot behov for å forbedre protokollen for farging, for å få Cellpose til å segmentere etter kanten av cellen bedre. Ved å bytte fra CPU til bruk av GPU med Cellpose, kan tiden bli ytterligere redusert for segmentering. Totalt sett så reduserte Cellpose tid brukt på segmentering og økte nøyaktigheten når en kontrollerte segmenteringene. | |
| dc.description.abstract | Background: Mycobacterium avium is a nontuberculous mycobacteria (NTM), closely related to Mycobacterium tuberculosis, and is the causative agent of NTM pulmonary diseases. The infection is difficult to treat and requires a regime of several different antibiotics often used in high dosages over an extended period of time. The severe side effects increase the chance of poor compliance regarding treatment, exposing patients to the development of resistance. Combined with an increase in prevalence in western developed countries, there is an urge for the development of alternative/additional treatment. Host directed therapy (HDT) is a different treatment approach that adds drugs targeting the host process, compared to the standard antibiotics regimen. This approach is preferable, reducing the number of antibiotics and thereby increasing quality patient quality of life, while ensuring the best outcome possible.
Aim: In this master thesis, we tried to establish an image acquisition/analysis platform.
Through adjustments regarding microscopy and experimentation with cell segmenting tools, a platform was developed. To validate the platform, a library of 10 different compounds was tested. This was done to see if any of the compounds affected the growth of M.avium.
Method: Peripheral blood mononuclear cells (PMBCs) were isolated from buffy coat, and monocytes were differentiated into macrophages over 6 days using the Macrophage Colony Stimulating Factor (M-CSF). Macrophages were infected with the strain M. avium 104 stably expressing DsRed and treated with the library.
With the use of confocal microscopy, images were obtained and analyzed with Cellpose and ImageJ, as a goal to obtain the intensity of fluorescence. The intensity of fluorescence was compared with the help of ANOVA testing.
Result: Cellpose was selected as a promising algorithm for reducing the time and increase the accuracy of cell segmentation. Different approaches to transfer the data from Cellpose to ImageJ were investigated. The use of a script from Github, ended up as the solution that gave the best result both regarding time and accuracy. To make the algorithm run even smoother, improvement of the staining protocol, could have improved the segmentation further. To reduce time spent, a switch from central processing unit (CPU) to graphics processing unit (GPU) it is recommended.
ANOVA showed that all 10 compounds had a lower bacterial burden than no treatment, some better than others. Metformin, GW9662, and zileuton showed the best effect compared to the control and looked like the most promising compounds compared to no treatment. 2-aminopurine (2-AP), simvastatin and mepenzolate showed the lowest effect compared to the control. Both simvastatin and metformin combined with antibiotics showed a statistically significant lower bacterial burden than no treatment with an adjusted p-value of 0.0008 for simvastatin and 0.0070 for metformin. There was, however, no statistically significant difference compared to treatment with just antibiotics.
Conclusion: Use of HDT compounds is a promising treatment option for M. avium. From the result, metformin, GW9662, and zileuton look like the most promising candidates, while 2-AP, simvastatin and mepenzolate turned out to have the lowest effect. These result was not statistically significant difference, but showed a tendency. Few donors were investigated, and there is a possibility of variation in the result, and it should be considered when evaluating the result.
The developed screening platform was a success. Cellpose turned out to be a good algorithm for segmentation of cells. However, there is a need of improving the staining of the cells to achieve detection within Cellpose at the edges of the cells even better. In retrospect, Cellpose reduced the time spent on cell segmentation and increased the accuracy when reviewing the segmentation. | |