Start-up of a nitrifying MBBR biofilter for a pilot-RAS operated at high salinity for grow-out salmon at Havlandet

Abstract

Den økende etterspørselen etter mat produsert på en miljøvennlig måte kan delvis bli løst med fiskeproduksjon i landbaserte resirkulerende akvakulturelle system (RAS). Vannet i RAS blir mekanisk og mikrobiologisk renset før det blir brukt om igjen i fiskeproduksjonen, noe som fører til bedre utnyttelse av ressursene i forhold til tradisjonelle gjennomstrømmingsanlegg ("flow-through systems", FTS). I den norske oppdrettsnæringen blir smolt som oftest produsert i fersksvanns-RAS før fisken blir flyttet til merder i sjøen. I det siste har det vært en økende interesse rundt produksjon av større laks i RAS for å begrense problemene med fiskelus og rømming i merdene. Det er industrielle utfordringer knyttet til nitrifiserende biofiltre i RAS ved høy salinitet, og forskjellige strategier for oppstart er derfor blitt brukt.

I denne masteroppgaven har to strategier for oppstart av nitrifiserende MBBR biofilter til bruk i en pilot-RAS ved en høy salinitet (25 ppm) for produksjon av slakteklar laks ved Havlandet RAS Pilot AS blitt undersøkt. Den første strategien ble startet med et flytende, kommersielt inokulum og rene biofilmbærere i et MBBR biofilter som ble matet med ammonium i en periode på 137 dager (Modningsperioden). Saliniteten varierte mellom 15 og 25 ppm. Det ble observert noe ammoniumoksidering, men også nitritt akkumulering til inhiberende nivå. Siden Modningsperioden ikke oppnådde vellykket nitrifisering, ble en ny strategi testet. Et MBBR biofilter ble inokulert med 1,5 m^3 biofilmbærere fra et annet RAS-anlegg adaptert til en salinitet på 15 ppm ved Erko Seafood. I løpet av 15 dager (Podeperioden) ble nye biofilmbærere tilsatt til et totalt volum på 81,5 m^3, og saliniteten ble økt fra 15 ppm til 25 ppm. Vellykket nitrifisering ble oppnådd etter bare noen få dager etter at biofilm inokulumet ble blandet med de nye biofilmbærerne. Et hovudfunn var at å bruke biofilmbærere som allerede var adaptert til høy salinitet som inokulum kan være en effektiv oppstartsstrategi for nitrifiserende biofilter i marine RAS.

Illumina sekvenseringen av amplikon variabel region 3 og 4 i 16S rRNA genet viste at en zOTU som representerer Nitrospira, hadde en forekomst på opp til 51 % av de totale avlesningene i biofilm inokulumet fra Erko. Denne zOTUen var beslektet med Nitrospira salsa. I tillegg ble det funnet en lav forekomst av ammoniumoksiderende bakterier i Podefilteret, noe som kan indikere at ammoniumoksiderende arker eller en comammox Nitrospira bidro til ammoniumoksideringen. Sanger sekvensering av et PCR-produkt av AOA amoA gener indikerte en tilstedeværelse av en AOA klassifisert som Nitrosopumilus oxyclinae. qPCR av amoA gener estimerte en høyere forekomst av AOB enn AOA i Podefilteret. Det ble konkludert med at AOA mest sannsynlig ikke bidrar vesentlig til ammoniumoksideringen i Podefilteret. PCR og qPCR av prøver fra det vellfungerende biofilteret for torskeproduksjon ved Havlandet indikerte at AOB var tilstede i biofilmen, men at det var en svært lav forekomst av AOA. Det var ikke indikasjoner på forekomst av comammox Nitrospira i noen av biofilm prøvene.

Det var en signifikant forskjell (p=0,0007) mellom de mikrobielle samfunnene i de to vellykkede nitrifiserende biofiltrene ved høy salinitet; Podefilteret og det vellfungerende biofilteret for torskeproduksjon ved Havlandet. Likevel var forekomsten av zOTUer som representerer nitrifiserende bakterier i biofilm samfunnene mye høyere for Podefilteret (opp til 77 % av de totale avlesningene) i forhold til det vellfungerende biofilteret for torskeproduksjon (opp til 4,2 %). Dette indikerer at biofilm samfunn med svært forskjellig sammensetning kan utføre nitrifisering ved høy salinitet.

The increasing demand for food produced in environmental friendly ways can partly be solved with fish production in land-based recirculating aquaculture systems (RAS). The water in RAS is mechanical and microbiological treated before it is reused for production of fish, in a way that results in better utilization of the resources compared to traditional flow-through systems. In the Norwegian aquaculture industry, smolt is commonly produced in freshwater RAS, before relocation for further production in seacages. Lately, it has been increasing interest for production of salmon at bigger size in RAS to limit the problems with fishlice and -escape in the seacages. Industrial challenges are linked to the function of nitrifying biofilters in RAS operated at high salinities, and several strategies for start-up is therefore used in marine RAS.

In this master thesis, two strategies for start-up of a nitrifying MBBR biofilter for use in a pilot-RAS at high salinity (25 ppm) for production of grow-out salmon at Havlandet RAS Pilot AS were investigated. In the first strategy, a liquid, commercial inoculum and clean biofilm carriers were used in a MBBR biofilter which was fed with ammonium in a period on 137 days (the Maturation period). The salinity was varying between 15 and 25 ppm. During the Maturation period it was observed some ammonium oxidization, but also some nitrite accumulation into inhibitory levels. Since the Maturation period did not result in a successful nitrifying biofilter, a new strategy was tested. A MBBR biofilter was inoculated with 1.5 m^3 biofilm carriers from another RAS operated at high salinity for post-smolt production at Erko Seafood. Over a period on approximately 15 days (the Poding period) new biofilm carriers were added to a total volume of 81.5 m^3 and the salinity was increased from 15 ppm to 25 ppm. It was achieved successful nitrification only a few days after the biofilm inoculum was mixed with the clean biofilm carriers. A major finding in this thesis was that the use of already adapted biofilm carriers to high salinity as inoculum is a effective start-up strategy of nitrifying biofilters for marine RAS.

The Illumina sequencing of amplicons encompassing variabel regions 3 and 4 of the 16S rRNA gene showed that one zOTU, representing Nitrospira, had a relative abundance of 51 % of the total reads for the biofilm inoculum sample from Erko. This zOTU was related to Nitrospira salsa. In addition, a low abundance of ammonium oxidizing bacteria was found in the Poding filter samples, which can indicate that comammox Nitrospira or AOAs were contributing to the ammonium oxidization in the Poding filter. Sanger sequencing of PCR products for AOA amoA genes indicated the presence of the AOA Nitrosopumilus oxyclinae. qPCR of amoA genes showed a higher abundance of AOBs than AOAs in the Poding filter. It was concluded that AOAs were probably not the major ammonium oxidizer in the biofilm community of the Poding filter. PCR and qPCR for samples from a well-functioning, marine biofilter for cod production at Havlandet, indicated that AOBs were present in the biofilm, but that AOAs were absent or very rare. There were no indications of comammox Nitrospira in any of the biofilm samples.

There were found a significant difference (p=0.0007) in the microbial communities in two successful marine, nitrifying biofilters; the Poding filter and the well-functioning biofilter for production of cod at Havlandet. Additionally, the relative abundance of zOTUs representing nitrifiers in the biofilm communities in the Poding filter was much higher (up to 77 % of the total reads) than in the well-functioning biofilter for cod production (up to 4.2 %). This indicates that biofilm communities of highly different composition can perform nitrification at high salinity.