Impact of CLN3 deficiency and Autophagy Lysosomal Pathway (ALP) in Neurodegeneration

Abstract

CLN3 Batten sykdom er en sjelden nevrodegenerativ lidelse som rammer barn. Sykdommen er forårsaket av mutasjoner i CLN3-genet, noe som blant annet fører til gradvis svekket syn som ender med blindhet, avtagende motoriske og kognitive evner og kramper. Symptomene starter i 4 til 7-års alderen, og de blir bare verre med tiden. Det gjør at de rammede barna ikke blir eldre enn 15 til 30 år gamle. Man vet lite om de biologiske prosessene relatert til CNL3-proteinet, men nåværende kunnskap indikerer at mangel på CLN3 er assosiert med dysfunksjoner i makroautofagi (ALP), som er en av de viktigste nedbrytningssystemene i celler. Det er bevist at slike funksjonsnedsettelser har stor påvirkning på nerveceller. En økende mengde forskning antyder i tillegg at endringer i funksjonaliteten til andre typer hjerneceller, som for eksempel gliaceller, også kan være en direkte konsekvens av CLN3-dysfunksjon. På grunnlag av manglende kunnskap om hvordan ALP påvirkes av CLN3-mangel i gliaceller, har det i dette studiet blitt generert menneskelige glia-forløperceller (GPC) og astrocytter in vitro. Disse cellene ble produsert ved å differensiere etablerte induserte pluripotente stamceller (iPSC), tidligere reprogrammert fra fibroblaster fra CLN3-pasienter og friske personer. Karakterisering av cellene bekreftet en vellykket reprogrammering til iPSC, og en heterogen populasjon av GPC og nevrale-forløperceller (NPC). Videre differensiering av forløpercellene, førte til dannelse av en blandet populasjon av gliaceller, bestående av gliaceller som fortsatt differensierte mot astrocytter (umodne astrocytter) og noen få modne astrocytter. GPC/NPC og astrocytter ble brukt til å evaluere uttrykket av autofagi-markører, måle autofagisk fluks, analysere levedyktighet ved eksponering av ALP-modulerende forbindelser, og til å måle mengden reaktive oksygenforbindelser (ROS) produsert i cellene både med og uten indusert stress. Målinger av autofagisk fluks indikerte at ALP er funksjonell i CLN3-muterte celler. Det ble heller ikke observert forskjell i genuttrykket av autofagi-gener, eller redusert levedyktighet for CLN3-pasientceller sammenliknet med kontrollceller ved eksponering av ALP-induserende forbindelser. Generelle og mitokondrielle ROS-nivåer for både ubehandlede og celler behandlet med H2O2, var heller ikke betydelig endret i pasientceller. Det er allikevel vesentlig å nevne at få pasient- og kontrollprøver, i tillegg til individuelle variasjoner, kan ha gjort at mulige forskjeller i biologiske responser mellom de to gruppene (pasient/kontroll) har blitt oversett. Uansett, så antyder resultatene at ALP er funksjonell i in vitro genererte CLN3-muterte GPC/NPC og videre differensierte gliaceller. Dette indikerer, dersom ALP virkelig er dysfunksjonell i gliaceller, at det er en mulighet for at endringer i nedbrytningssystemet blir mer tydelig i fullstendig differensierte astrocytter. Alternativt, så kan det hende CLN3-mangel fører til dysfunksjoner i andre cellulære prosesser i gliaceller, uavhengig av ALP, som bidrar til nevrontapet som er observert i pasienter rammet av CLN3 Batten sykdom.

CLN3 Batten disease is a rare neurodegenerative disorder affecting children. It is caused by mutations in the CLN3 gene, and emerges as impaired vision followed by blindness, decline in motor and cognitive abilities, and seizures. The symptoms become progressively worse, resulting in premature death at 15 to 30 years of age. Much is yet unknown about the biological processes regulated by the CLN3 protein. Current knowledge indicates that deficiency of CLN3 in patients is associated with abnormalities in the major cellular degrading system, namely the autophagy lysosomal pathway (ALP), and such dysfunctions have great impact on neurons. An increase body of evidence, however, suggests that alterations on the functionality of other types of brain cells, such as glial cells, may also be a direct consequence of CLN3 loss of function. Thus, due to the paucity of data regarding the impact of CLN3 deficiency on ALP in glial cells, we generated in vitro human glial progenitor cells (GPC) and astrocytes. These cells were produced via differentiation of previously established induced pluripotent stem cells (iPSC), which were reprogrammed from fibroblasts obtained from CLN3 patients and healthy donors. Characterization of cells revealed a successful generation of iPSC, and a heterogeneous population of GPC and neural progenitor cells (NPC). Further differentiation of the progenitor cells resulted in a mixed population of glial cells, consisting of glial cells still differentiating towards astrocytes (immature astrocytes) and few mature astrocytes. GPC and astrocytes were used to evaluate the expression of autophagy markers, measure autophagic flux, verify cell viability upon exposure to ALP modulating agents and to assess intracellular reactive oxygen species (ROS) production with and without stress induction. Analysis of autophagic flux indicate that ALP is functional in CLN3-deficient glial cells. Moreover, no difference in gene expression of ALP markers or reduced viability in CLN3 mutated patient glial cells was observed compared to control cells. General and mitochondrial ROS levels, both for untreated and H2O2 treated cells, were not distinctly altered in the patient group. It should be noted, however, that the small number of samples, together with individual variations, could have masked potential distinctions in biological responses between the two groups (control/patient). Nevertheless, the data suggest that ALP is functional in in vitro generated GPC/NPC and further differentiated glial cells of CLN3 patients. This indicates that, if ALP is dysfunctional in glial cells, the alterations may become more evident in fully mature astrocytes. Alternatively, CLN3 deficiency may cause dysregulation in other cellular processes in glial cells, independent on ALP, which in turn may contribute to the enhanced neuron loss reported in CLN3 Batten disease patients.