Microbial Exopolysaccharides: Evaluation of Glycosyltransferase GumM and 13C Isotope-Labeling of Bacterial Cellulose

Abstract

Mikrobielle eksopolysakkarider er en mangfoldig underkategori av ekstracellulære polymeriske stoffer som utskilles av mikroorganismer. Disse forbindelsene har som regel høy molekylvekt og består av monomerer som er sammenkoblet av glykosidiske bindinger. Sammen utgjør de en gruppe biomaterialer med ulike fysiokjemiske egenskaper og anvendelser, avhengig av sammensetningen. De er blant annet brukt innenfor det biomedisinske feltet, så vel som i næringsmiddel-, petroleum- og kosmetikkindustrien. Mikrobielle eksopolysakkarider har et stort potensial som bærekraftige materialer ettersom de er utvunnet fra fornybare kilder. De er i tillegg biologisk nedbrytbare, som åpner for videre bruk av dem som alternativer til fossile brensler. Den motstandsdyktige naturen til mange biopolymerer har vært en betydelig hindring for bioraffinerier, men de relativt nyoppdagede lytiske polysakkaridmonooksygenasene (LPMOer) har revolusjonert feltet. Disse enzymene forbedrer depolymeriseringen av krystallinske substrater ved å gjøre dem mer tilgjengelige for de tradisjonelle glykosylhydrolasene. Mye gjenstår enda i forståelsen av det biosyntetiske og bionedbrytende maskineriet som er ansvarlig for behandling av disse stoffene. Med økt kunnskap kan produksjonskostnadene reduseres, nye forbindelser utformes med egenskaper som er skreddersydd for ulike behov og det fulle potensialet for de nedbrytende enzymene kan realiseres.

Dette prosjektet har vært rettet mot produksjon, rensing og evaluering av glykosyltransferasen GumM, involvert i biosyntese av xantangummi, samt produksjon og nedbryting av bakteriell cellulose (BC). Tre homologer av GumM fra Xanthomonas Campestris LMG 8031 (Xcc), Kozakia baliensis SR 745 (Kb) and Komagataeibacter sucrofermentas (Ks) ble studert. En C-terminalavkortet versjon av Kb-homologen av GumM (Kb∆C) ble rekombinant uttrykt fra pTYB1-ekspresjonsvektoren ved brukt av IMPACT-CN-rensesystemet. Evaluering av enzymet ved bruk av 1H-NMR og differensiell skanningfluorimetri avslørte at proteinet mest sannsynlig var ufoldet og/eller aggregert. En homologimodell ble konstruert basert på 22 % sekvenslikhet med den nylig karakteriserte glykosyltransferasen TagA (PDB ID: 5WFG) fra Thermoanaerobacter italicus. Dette bidro til å peke ut enkelte aminosyrer som kan ha viktige funksjoner i det aktive setet til Kb∆C, men dette må undersøkes nærmere i fremtidige studier.

BC-produksjon ble studert i Komagataeibacter xylinus DSM 2325. En rensingsprotokoll ble utarbeidet for å minimere mengden urenheter ved bruk av 1H-NMR og HPAEC-PAD for å analysere sammensetningen. Young’s modulus av materialet ble målt til 3000-5000 Pa, som er mye lavere enn tidligere rapporterte verdier, som sannsynligvis skyldes at prøvene var av utilstrekkelig tykkelse for gode målinger. For å samtidig verifisere at materialet var BC og demonstrere hvordan isotopmerking av substrater kan brukes til å studere enzymatisk nedbrytning, ble BC beriket med 13C og utsatt for nedbryting av de cellulolytiske enzymblandingene Cellic® CTec2 og Cellic® CTec3 HS og modell-LPMOen, ScLPMO10A. Nedbrytingen ble overvåket ved tidsoppløst 13C-NMR-spektroskopi. De kjemiske skiftene av nedbrytningsproduktene samsvarer med verdiene som tidligere er rapportert for de forventede produktene (α- og β-glukoser, aldolaktoner og aldonsyrer). Resultatene viser noen måter som 13C-beriket BC kan brukes på i videre studier for å karakterisere enzymkinetikken og mekanismene til cellulolytiske enzymer.

Microbial exopolysaccharides are a diverse sub-category of the extracellular polymeric substances excreted by microorganisms. Consisting of monomers joined through glycosidic linkages, these high molecular weight compounds make up promising biomaterials. With numerous different physio-chemical properties, depending on their composition, their applications range from the biomedical field to the food, petroleum and cosmetic industries, to name a few. As microbial exopolysaccharides are obtained from renewable sources, they show great potential as sustainable materials. The biodegradable nature of these biopolymers further opens for the use of exopolysaccharides as alternatives to fossil fuels. The recalcitrant nature of many biopolymers has been a considerable obstacle for biorefineries, but the recent discovery of the lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) has revolutionized the field. These enzymes enhance depolymerization of crystalline substrates, making them available to the traditional glycosyl hydrolases. Much remains to be understood about both the biosynthetic and biodegrading machinery described here. With increased knowledge, the production costs can be reduced, compounds can be designed with novel properties that can be tailored for various needs and the full potential of the biodegrading enzymes can be realized.

This project was aimed at production, purification and evaluation of the glycosyltransferase GumM, involved in biosynthesis of xanthan gum, as well as production and degradation of bacterial cellulose. Three homologs of GumM were obtained from Xanthomonas Campestris LMG 8031 (Xcc), Kozakia baliensis SR 745 (Kb) and Komagataeibacter sucrofermentas (Ks). A C terminal truncated version of the Kb homolog of GumM (Kb∆C) was recombinantly expressed from the pTYB1 expression vector, using the IMPACT-CN purification system. Evaluation of the enzyme by 1H-NMR and differential scanning fluorimetry revealed that the protein was most likely unfolded and/or aggregated. A homology model was constructed based on 22 % sequence similarity with the recently characterized glycosyltransferase TagA (PDB ID: 5WFG) from Thermoanaerobacter italicus. The model suggested some amino acids with important functions in the active site of Kb∆C, though further studies are needed to verify this.

BC production was studied in Komagateibacter xylinus DSM 2325. A purification protocol was made to ensure minimal impurities, using 1H-NMR and HPAEC-PAD to analyze the composition. The Young’s modulus of the material was measured to 3000-5000 Pa, much lower than previously found, which is likely due to insufficient thickness of the sheet for proper measurements. To verify that the material was bacterial cellulose, and to demonstrate how isotope-labeling of substrates can be used to study enzymatic degradation, the BC was enriched with 13C and subjected to degradation by cellulolytic enzyme cocktails Cellic® CTec2 and Cellic® CTec3 HS and model LPMO, ScLPMO10A. The degradation was monitored by time-resolved 13C-NMR spectroscopy. The chemical shifts of the degradation products corresponded with the values previously reported for the expected products (α- and β-glucoses, aldolactones and aldonic acids). The results demonstrate some ways that 13C-enriched BC can be used in further studies to characterize the enzyme kinetics and mechanisms of cellulolytic enzymes.