Development of a chassis organism based on CRISPR-Cas engineering in Paenibacillus polymyxa

Abstract

Paenibacillus polymyxa DSM 365 er en bakterie som har vist lovende potensial som produksjonsvert for eksopolysakkarider, antimikrobielle forbindelser og kjemikalier som 2,3-butandiol. Ved å utvikle denne bakterien i retning av en modell organisme, kan den gjøres bedre rustet for industriell produksjon, samtidig som utbyttet og renheten av produktene øker. Målet med denne avhandlingen er å innføre genmodifiseringer i P. polymyxa som skal bidra til å utvikle bakterien i retning av en modell organisme. Syv nye mutasjonsstammer med slettinger av gener for Pektin lyaser, endospore dannelse, og deler av paenan genklyngen har blitt utviklet. I tillegg har CRISPR-Cas systemer blitt konstruert og verifisert for sletting av UDP-glukose dehydrogenaser, andre del av paenan genklyngen, samt alle genene for paenan biosyntese. Prosedyrene for overføring av plasmid til P. polymyxa stammer via konjugasjon har blitt optimalisert ved å studere effekten mineraler i næringskildene har på rekombineringen. Suksessfull elektroporering har åpnet opp for en alternativ overføringsmekanisme for plasmid. Videre arbeid inkluderer verifisering av sletting av paenan genklyngen og UDP-glukose dehydrogenasene. I tillegg gjenstår sletting av antimikrobielle biosyntese genklynger, og videre karakterisering av mutasjonsstammene.

Paenibacillus polymyxa DSM 365 is a bacterium that has shown great potential as a producer of exopolysaccharides, antimicrobial compounds and chemicals such as 2,3-butanediol. Chassis development of this organism can make it more suitable for industrial production by improving product yield and purity. The aim of the thesis is to perform CRISPR-Cas mediated deletions of target genes in P. polymyxa to develop it towards a chassis organism. Seven novel mutant strains with deletions of genes for Pectin lyases, endospore formation proteins and part of the paenan biosynthetic gene cluster were developed. Additional CRISPR-Cas systems were assembled for the deletion of UDP-glucose dehydrogenases, the second part of the paenan cluster, and the entire paenan cluster. The transfer of plasmids to P. polymyxa were improved by optimizing the procedure for conjugation and demonstrating successful electroporation. Future work includes the verification of the deletions of the paenan gene cluster, deletion of the identified antimicrobial biosynthetic gene clusters, and further characterization of the mutant strains.