An Expansion of Aspergillus niger's Promoter Library: Promoter strength screening via CRISPR-Cas9-mediated genomic integration of luciferase expression constructs

Abstract

Muggsopp utnyttes i økende grad som industrielle produksjonsorganismer, og Aspergillus niger er for tiden den mest betydningsfulle og studerte arten blant dem. Naturlige produkter, inkludert sekundære metabolitter og organiske syrer, produseres med høye utbytter og titere i disse cellulære biofabrikkene. Derimot er fremstilling av ikke-naturlige produkter, som rekombinante proteiner med høy verdi, begrenset på grunn av ufullstendige forståelser av de relevante cellemekanismene, samt en underutviklet verktøykasse for genteknologi (‘‘genetic toolbox’’). For å optimalisere heterolog produksjon i disse vertene, må det være tilgjengelig et utvalg av konstitutive promotorer med karakteriserte styrker. Derfor tok denne forskningen sikte på å ekspandere den genetiske verktøykassen til A. niger ved å utvide promotorbiblioteket.

Her ble 19 kandidater for nye konstitutive promotorer valgt ut og klonet inn i praktiske moduler, før 4 av de antatte promotorsekvensene ble studert ved hjelp av reporter-basert analyse. Ved å bruke MoClo-metoden til kloning og CRISPR-Cas9-teknologi til genomredigering, ble ekspresjonskassetter som plasserte luciferase-reportergenet under kontroll av varierende promotorer konstruert og integrert i et forhåndsdefinert genomisk lokus. Bioluminescens ble deretter overvåket for å kvantifisere enzymaktiviteten til luciferase, noe som forventes å svare til promotorens styrke. Også en alternativ reporter, det fluorescerende proteinet DsRed, ble testet for funksjonalitet i et pre-eksperiment. Det ble funnet at den luciferase-baserte analysen var en pålitelig indikator på relative promotorstyrker, fordi den viste de samme resultatene i to separate eksperimenter. Videre var disse resultatene sammenlignbare med forutsigelser om promotorstyrker, som ble gjort basert på en tidligere publisert meta-analyse av A. niger-transkriptom.

Denne forskningen har iverksatt en særdeles nødvendig utvidelse av A. nigers promotorbibliotek. Selv om de fire promotorene som ble studert her fortsatt krever ytterligere analyse for å bli fullstendig karakterisert, og flere enn disse fire konstitutive promotorene fortsatt bør legges til biblioteket, gir det som ble funnet her et verdifullt utgangspunkt for fremtidig forskning med lignende mål.

Filamentous fungi are increasingly being exploited as industrial production organisms, and Aspergillus niger is currently the most significant and studied species among them. Natural products, including secondary metabolites and organic acids, can be collected in high-yield titers from these cellular biofactories. However, production of non-native compounds, such as high-value recombinant proteins, remains limited by an incomplete understanding of relevant cellular mechanisms as well as an underdeveloped genetic engineering toolbox. In order to optimize heterologous production in these hosts, a range of constitutive promoters with characterized strengths needs to be readily available. Therefore, this research aimed to expand the genetic toolbox of A. niger by augmenting the promoter library.

Here, 19 candidates for novel constitutive promoters were selected and cloned into convenient modules, before 4 of the putative promoter sequences were screened in a reporter assay. Using the MoClo method for cloning and CRISPR-Cas9 technology for genome editing, expression cassettes putting luciferase reporter genes under the control of alternate promoters were constructed and integrated in a pre-defined genomic locus. Bioluminescence was then monitored to quantify the enzyme activity of luciferase, which is expected to correspond to promoter strength. Also an alternative reporter, the fluorescent protein DsRed, was briefly tested for functionality in a pre-experiment. It was found that the luciferase assay was a reliable indicator of relative promoter strengths, showing the same results in two separate assays. Furthermore, these results were comparable to promoter strength predictions that were made based on a previously published meta-analysis of the A. niger transcriptome.

This research initiates a much-needed expansion of A. niger's promoter library. Although the four promoters that were studied here still require further analysis to complete their characterizations, and a greater quantity than these four constitutive promoters should still be added to the library, what was found here provides valuable starting ground for future research with similar objectives as this.