Engineering of Orthogonal Aminoacyl tRNA Synthetase/tRNA Pairs for Codon Reassignment in the Chloroplast of Chlamydomonas reinhardtii

Abstract

Mikroalger etablerer seg som en attraktiv produksjonsplatform for rekombinante proteiner og andre biobaserte produkter. Kloroplasten opprettholder sitt eget maskineri for proteinsyntese og et kompakt kromosom, som på enkelt vis kan manipuleres og dermed etablerer organellen som et spennende område innenfor syntetisk biologi. Slike egenskaper gjør kloroplasten til et ideelt mål for kodon omdisponering for å endre eller utvide den genetiske koden via bruk av flere aminosyrer. Inkorporering av slike ikke-kanoniske aminosyrer under proteinsyntese kan både forbedre eksisterende egenskaper eller sørge for tilegning av nye egenskaper. Aminoasyl tRNA syntetase/tRNA parr har tidligere vært benyttet for kodon omdisponering i flere ulike mikroorganismer, men til nå har ikke mikroalgers kloroplast vært et mål.

Arbeidet som er presentert i denne avhandlingen etablerer molekylære verktøy for å kunne identifisere og utnytte ortogonale translasjonsystemer for inkorporering av ncAA under proteinsyntese i kloroplasten til mikroalgen Chlamydomonas reinhardtii.

Vektorer som inneholder genetisk konstrukt for omdisponering av opal stoppkodon ble konstruert, som er en betingelse for å kunne inkorporere ikke-kanoniske aminosyrer. Gener som koder for pyrrolysyl-tRNA syntetaser fra Methanomethylophilus alvus, Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei ble genetisk kombinert med gener for opal-supressor tRNA. Disse pyrrolysyl-tRNA syntetasene har tidligere blitt optimalisert for affinitet til ikke-kanoniske aminosyrer. Alle vektorene ble konstruert med et aadA gen som sørger for resistans mot spektinomysin. Flankerende sekvenser ble også benyttet for å tilrettelegge for homolog rekombinasjon med kloroplast lokuset psbH. I tillegg ble et gen som koder for fluoriserende mVenus, med ett ekstra opal kodon innsatt, benyttet som rapportørgen.'Start-Stop assembly' ble benyttet for å konstruere funksjonelt arrløse gener. Start og stopp kodoner fungerte som fusjonsområder mellom promoter/5'utranslatert region, kodende sekvens og 3'utranslatert region. Disse vektorene danner en effektiv verktøykasse for å etablere og analysere inkorporering av ikke-kanoniske aminosyrer i proteiner syntetisert i kloroplasten til Chlamydomonas reinhardtii.

Microalgae are emerging as an attractive production platform for the synthesis of recombinant proteins and other biobased products. The chloroplast maintains its own protein synthesis machinery and a compact chromosome, which can be easily manipulated, establishing it as an attractive site within the field of synthetic biology. Features like these make the chloroplast an ideal target for codon reassignment to alter or expand the genetic code through the utilization of additional amino acids. Incorporating such non-canonical amino acids (ncAA) during protein synthesis could improve existing characteristics or facilitate the acquisition of new functionalities. Aminoacyl tRNA synthetases (aaRS)/tRNA pairs have been previously utilized for codon reassignment in several microorganisms. Yet, so far, the chloroplast of microalgae has not been targeted.

The work presented in this thesis establishes the molecular tools to identify and utilize orthogonal translation systems for the incorporation of ncAA during protein synthesis in the chloroplast of the microalgae Chlamydomonas reinhardtii.

Vectors containing genetic constructs for reassigning opal stop codon were constructed, a requirement for the incorporation of ncAA. Genes encoding pyrrolysyl-tRNA synthetase from Methanomethylophilus alvus, Methanosarcina barkeri and Methanosarcina mazei that have been previously optimized for enhanced affinity towards different ncAA, were genetically combined with genes for cognate opal-suppressor tRNA. All vectors were assembled with aadA gene conferring spectinomycin resistance and flanking sequences for homologous recombination within the psbH chloroplast locus. The gene for fluorescent protein mVenus, engineered to contain an additional opal codon, was included as the reporter gene. Functionally scarless vectors were constructed utilizing the Start-Stop Assembly, where start and stop codons served as fusion sites between promoter/5'untranslated region (UTR), coding sequence and 3'UTR of each gene. These vectors provide an efficient toolbox for establishing, analyzing and refining the incorporation of ncAA in proteins synthesized in the chloroplast of Chlamydomonas reinhardtii.