Characterization of two Janthinobacterium sp. related to fish-skin and their ability to produce exopolysaccharides and violacein

Abstract

Janthinobacterium er en slekt av Gram-negative bakterier som har blitt isolert fra forskjellige miljøer som jord og akvatiske miljøer, inkludert Antarktis. Stammer av Janthinobacterium viser typisk en tydelig fiolett farge forårsaket av violacein. Violacein er et pigment som produseres av den biokjemiske aktiviteten til bakteriene under metabolismen og antas å være en reaksjon på miljøspenninger og fungerer som en forsvarsmekanisme mot ytre farer. Janthinobacterium stammer produserer også ekstracellulære polymere stoffer som inneholder eksopolysakkarider (EPS). Stammer av bakteriene har også vist seg å produsere en sterk biofilm som er rik på eksopolysakkarider. Nyere studier har ført til identifiseringen av en ny EPS produsert av en Janthinobacterium sp. relatert til fiskehud. Denne EPS-produksjonen av Janthinobacterium sp. har ikke blitt fullstendig karakterisert, og den potensielle rollen under kolonisering på fiskeskin er ennå ikke helt forstått. Siden begrenset informasjon er tilgjengelig, ble to stammer av Janthinobacterium isolert fra fiskehud før dette eksperimentet, evaluert for å forstå hvilke dyrkningsforhold som er best egnet for EPS-produksjon, og om EPS produksjonen er knyttet til produksjonen av violacein. De to stammene, MM5 og 3.116, ble klassifisert basert på deres 16S rRNA-sekvenser og karakterisert basert på deres vekst på LB, TSB og EPS-medier. Antibiotisk mottakelighet av stammene ble testet med et antiogram. Violaceinproduksjon av stammene MM5 og 3.116 ble vurdert ved dyrking på fast og flytende LB-medium. For å undersøke om stammene var i stand til å produsere EPS, ble de dyrket i LB-, TSB- og EPS-medier. Biofilmformasjon ble vurdert ved å teste MM5 i de forskjellige mediene og ved en "biofilm assay". For å undersøke gener relatert til biosyntesen av violacein og EPS ble genklynger analysert. Identifiserte gener relatert til violacein og EPS-biosyntese ble deretter analysert videre for å bestemme om det var noen felles Janthinobacterium-stammer mellom dem. MM5 og 3.116 ble begge klassifisert som stammer av slekten Janthinobacterium. Stammene hadde forskjellige egenskaper når de ble dyrket på LB og TSB media. MM5 var viskid og slimete og 3.116 hadde en slimaktig konsistens når de ble dyrket på solid LB-medium. Når stammene ble dyrket i flytende TSB og LB-medier, var MM5 tyktflytende og med noen filamenter, mens 3.116 var mer flokkulerende og turbid. Mikroskopisk analyse viste at celler fra begge stammer var stavformet og vokste i klumper/aggregater. Antibiogram viste at begge stammene var sensitive overfor ampicillin og kloramfenikol, og motstandsdyktige mot kanamycin, neomycin og polymyxin. Violaceinproduksjon ble observert fra MM5 når den ble dyrket på fast LB-medium, mens 3.116 viste noen tegn på violaceinproduksjon når den ble dyrket på et solid EPS-medium med sukrose som karnonkilde. EPS-produksjon ble bare observert fra MM5 når den ble dyrket i flytende TSB-medium. Ingen EPS-produksjon ble observert fra 3.116. MM5 ble videre testet i forskjellige mediesammensetninger for å analysere EPS-produksjon og biofilmdannelse. TSB viste seg å være det eneste mediet som var i stand til å gi de optimale betingelsene for tydelig EPS-produksjon fra MM5. Biofilmdannelse av MM5 så ut til å være forhøyet når ytterligere salt ble tilsatt. Analyse av genetiske komponenter involvert i biosyntesen av violacein og EPS viser at det er Janthinobacterium-stammer som inneholder begge.

Janthinobacterium is a genus of Gram-negative bacteria that have been isolated from various environments such as soil and aquatic environments, including Antarctica. Strains of Janthinobacterium typically show a distinct violet color caused by the pigment violacein. Violacein is a compound that is produced by the biochemical activity of the bacteria during metabolism and is believed to be a response to environmental stresses and functions as a defense mechanism against external dangers. Janthinobacterium strains also produce extracellular polymeric substances, which contain exopolysaccharides (EPS). Several Janthinobacterium strains have shown to produce a strong biofilm that contains exopolysaccharides. Exopolysaccharide production by Janthinobacterium sp. has not been fully characterized and its potential role during colonization on fish skin is not yet fully understood. Since limited information is available, two strains of Janthinobacterium isolated from fish skin prior to this experiment, were evaluated to understand which cultivation conditions are most appropriate for EPS production and if it is connected to the production of violacein. The two strains, MM5 and 3.116, were classified for their 16S rRNA sequences and characterized based on their growth on LB, TSB, and EPS media. The antibiotic susceptibility of the strains was tested by an antibiogram. Violacein production of strains MM5 and 3.116 were assessed by cultivation on solid and liquid LB medium. To investigate if the strains were capable of producing EPS, they were cultivated in LB, TSB, and EPS media. Biofilm formation was assessed by testing MM5 in the various media and by a biofilm assay. To investigate genes related to the biosynthesis of violacein and EPS, gene clusters that encode for violacein production and putative EPS operons were analyzed. Identified genes related to violacein and EPS biosynthesis were then further analyzed to determine if there were common in different Janthinobacterium strains. MM5 and 3.116 were both classified to be strains of the genus Janthinobacterium. The strains had different characteristics when grown on LB and TSB media. MM5 was viscid and slimy, and 3.116 had mucoid consistency when grown on solid LB medium. When grown in liquid TSB and LB media, MM5 was viscous and somewhat filamentous, while 3.116 was more flocculent and turbid. Microscopic analysis showed that cells of both strains were rod-shaped and grew in aggregates. Antibiogram showed that both strains were sensitive towards ampicillin and chloramphenicol, and resistant towards kanamycin, neomycin, and polymyxin. Violacein production was observed from MM5 when cultivated on solid LB medium, while 3.116 did show some signs of violacein production when cultivated on a solid EPS medium with sucrose as carbon source. EPS production was observed only from MM5 when cultivated in liquid TSB medium. No EPS production was observed for 3.116. MM5 was further tested in various adjusted media compositions to analyze EPS production and biofilm formation. TSB was proven to be the only medium capable of providing the conditions for clear EPS production by MM5. Biofilm formation of MM5 seemed to be elevated when additional salt was added. Analysis of genes involved in the biosynthesis of violacein and EPS shows that there are Janthinobacterium strains that encode both biosynthetic pathways in their genome.