Metabolic engineering of Bacillus methanolicus towards methanol-based lactam production

Abstract

Industriell bioteknologi er en av de største og mest fremtidsrettede feltene som har vokst fram i det 21ste århundret. Det har mange applikasjoner innen viktige industrielle områder som medisin, planteproduksjon, og miljøbruk. Som følge av økt fermentisk produksjon av verdifulle komponenter eller biobrensel har bruken av sukker råstoffer økt proporsjonalt, medfølgende en større miljøpåvirkning. Metanol har nylig fått økt interesse som et potensielt fornybart substrat for bioteknologiske prosesser. Det konkurrerer ikke med mat, kan transporteres enkelt, og har sunket gradvis i pris over det siste tiåret. Overdreven bruk og forkastelse av plastikk har vært et lenge pågående problem som har fått mer og mer oppmerksomhet. Nylon brukes i mange applikasjoner på stor skala, slik som tekstiler, ledninger, former, og emballasje. Nylon-4, et potensielt polymerisert produkt av butyrolactam, har nesten lik strekkfasthet og varmeresistans som det globalt produserte nylon-6, men er mye lettere nedbrytbart i naturen. Bacillus methanolicus er en Gram-positive, termotolertant methylotroph, kjent for naturlig evne for L-glutamate produksjon. B. methanolicus MGA3 ble her konstruert for produksjon av laktamer (butyrolactam, valerolactam, og caprolactam). Den kontinuerlige vektoren pMI2mp og den xylose induserte vektoren pBV2xp ble utnyttet for ekspresjon. Siden en bakteriestamme for produksjon butyrolactam-forløperen GABA allerede er konstruert, bør en metabolsk vei for butyrolactam sekresjon være håndgripelig. For å oppnå dette ble β-alanine CoA transferase (Act); som katalyserer ringslutning av lactam-forløperne GABA, 5AVA, og ACA til henholdsvis butyrolactam, valerolaktam, og caprolactam, kodon optimisert og integrert. Mens B. methanolicus ikke kunne bli besluttet som en lactam produsent gav ekspresjonen av act en indikasjon av butyrolactam produksjon i Escherichia coli.

Industrial biotechnology is one of the most prominent and futuristic fields of the 21st century, with many applications within essential industrial areas including health care, crop production, or environmental uses. As fermentative production of added-value compounds has increased, so too have the environmental impact from the amount of sugar substrates used to feed it. Methanol have recently gained more and more interest as a potential renewable substrate for biotechnological processes. It is a non-food product that can be easily transported and have seen a decline in price the past decade. Excessive use and littering of plastic have been a long-going problem that is gaining more and more awareness across the globe. Nylon is currently being used in many large-scale applications such as textiles, lines, moulds and as the film used for food packaging. Nylon-4, a possible polymerized product of butyrolactam, have shown almost equal tensile and heat-resistive traits as the globally produced nylon-6, but is much more easily degradable in nature. Bacillus methanolicus is a Gram-positive, thermotolerant, methylotroph, with known natural capabilities for L-glutamate production. Here, B. methanolicus MGA3 was engineered for production of lactams (butyrolactam, valerolactam and caprolactam). The constitutive vector pMI2mp and the xylose inducible vector pBV2xp were utilized. Since a strain capable of producing the butyrolactam precursor GABA have already been engineered, a pathway for butyrolactam secretion should be tangible. To achieve this pathway, the β-alanine CoA transferase (Act) catalyzing cyclization of the precursors GABA, 5AVA, and ACA into butyrolactam, valerolactam, and caprolactam, respectively, were codon optimized and integrated. While B. methanolicus could not be confirmed as lactam producer, the expression act resulted in indication of butyrolactam production in Escherichia coli.